[發(fā)明專(zhuān)利]一種原位雜交探針

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010469896.3
• 申請(qǐng)日: 2020-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111676271B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林錦梅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州燁善生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6841
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環(huán)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發(fā)明提供一種原位雜交探針，包括探針序列和信號(hào)基團(tuán)序列。本發(fā)明的探針序列的設(shè)計(jì)，用莖環(huán)序列連接接頭序列和檢測(cè)序列，既增加探針的穩(wěn)定性，也為兩次配對(duì)識(shí)別提供了先決條件；應(yīng)用探針和目標(biāo)、探針和信號(hào)序列的兩次配對(duì)識(shí)別，提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)準(zhǔn)確性，減少背景信號(hào)，降低假陽(yáng)性的概率；信號(hào)序列的引入，使后續(xù)檢測(cè)更加靈活，降低實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)后續(xù)可擴(kuò)展性能更加優(yōu)良。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種原位雜交探針。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)原位雜交探針的設(shè)計(jì)是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，針對(duì)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)合成單一的線性寡核苷酸探針，其長(zhǎng)度范圍多為30-200bp。寡核苷酸探針的末端進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記或其他檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記，溶于雜交緩沖液后直接用于原位雜交的檢測(cè)，探針通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別目的基因序列并結(jié)合，或使用檢測(cè)二抗進(jìn)行檢測(cè)。其后通過(guò)普通或熒光顯微鏡觀測(cè)熒光信號(hào)雜交信號(hào)。此檢測(cè)過(guò)程，基本為“探針——目的序列”的單次識(shí)別配對(duì)，此配對(duì)的準(zhǔn)確性，決定了此實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程的特異性或準(zhǔn)確性。

由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中探針與目的序列的單次識(shí)別配對(duì)，探針的非特異結(jié)合或引起假陽(yáng)性，或者導(dǎo)致背景信號(hào)高；同時(shí)，檢測(cè)基團(tuán)直接與探針相連，缺少靈活性和升級(jí)空間，因此缺少特異性高，增幅效果好的信號(hào)放大系統(tǒng)。對(duì)于含量低的目標(biāo)分子，較難得到優(yōu)質(zhì)的特異陽(yáng)性信號(hào)；容易受不同樣本的組織結(jié)構(gòu)，物理環(huán)境的不同所影響，產(chǎn)生高背景或假陽(yáng)性。因此，單條線性探針的穩(wěn)定性有所欠缺。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明引入雙探針系統(tǒng)，增加對(duì)目標(biāo)序列的識(shí)別能力與特異性。引入了“探針-目的序列”和“探針-信號(hào)序列”的兩次識(shí)別配對(duì)，以及雙探針之間的配合識(shí)別，大大降低非特異結(jié)合或樣本結(jié)構(gòu)引起的假陽(yáng)性或高背景信號(hào)；信號(hào)序列的加入，也可以擴(kuò)展出一個(gè)高效的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，使特異信號(hào)得到有效的放大，應(yīng)對(duì)低表達(dá)量目的分子的檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種原位雜交探針，包括探針序列和信號(hào)序列。

進(jìn)一步地，所述探針序列包括5’端接頭序列、中部連接序列和3’端目的基因檢測(cè)序列。本發(fā)明的5’端接頭序列是根據(jù)一種線蟲(chóng)基因組設(shè)計(jì)的匹配序列，與人、大鼠、小鼠的基因序列沒(méi)有同源性，無(wú)特異結(jié)合，可用于結(jié)合后續(xù)的級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)。

進(jìn)一步地，所述中部連接序列具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的探針序列的中部連接序列在常溫或非雜交緩沖液環(huán)境下形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可提高探針的穩(wěn)定性，增加探針的特異性；同時(shí)提供合適的空間構(gòu)象，連接5’端序列和3’檢測(cè)序列。

進(jìn)一步地，所述3’端目的基因檢測(cè)序列不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且根據(jù)所要檢測(cè)的目的基因設(shè)計(jì)堿基序列。本發(fā)明探針序列的3’端檢測(cè)序列按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，根據(jù)需要檢測(cè)的目的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，通常針對(duì)目的序列的3’端特異保守區(qū)，30-50bp長(zhǎng)度，GC％為40％-60％，此段區(qū)域避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

根據(jù)上述對(duì)本發(fā)明的探針序列的描述，所述探針序列的具體序列如下：TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGAcaagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGA AGAACATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA(SEQ ID NO:1)是探針序列的5’端接頭序列，caagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAGAACAT(SEQ ID NO:2)是探針序列的中部連接序列(莖環(huán))，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是探針序列的3’端檢測(cè)序列，其根據(jù)需要檢測(cè)的目的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，本發(fā)明完整的探針包含此三個(gè)區(qū)域，其形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

進(jìn)一步地，所述信號(hào)序列包括兩個(gè)可與所述探針序列的5’端接頭序列特異結(jié)合的序列，以及連接兩個(gè)所述標(biāo)記序列的中部延長(zhǎng)序列