[發(fā)明專(zhuān)利]一種廣宿主表達(dá)載體、基于該載體制備的重組BacMam病毒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010467041.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111748584A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高明春;郭永麗;杜繼文;王君偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/866
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/866;C12N15/65;C12N15/40;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發(fā)明公開(kāi)了一種廣宿主表達(dá)載體、基于該載體制備的重組BacMam病毒及其應(yīng)用。所述的廣宿主表達(dá)載體是以pACEMam1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為基礎(chǔ)骨架，對(duì)其啟動(dòng)子、融合標(biāo)簽與多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造，使其可以在大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及昆蟲(chóng)細(xì)胞中均能表達(dá)目的蛋白。此外，本發(fā)明還提供了攜帶紅色熒光蛋白(mcherry)基因的廣宿主表達(dá)載體，便于鑒定該載體系統(tǒng)是否正常工作并可選擇其作為報(bào)告基因來(lái)表達(dá)具有熒光特性的外源基因。基于該廣宿主表達(dá)載體，本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)BVDV2?E2的重組BacMam病毒，該重組BacMam病毒在哺乳細(xì)胞表達(dá)的同時(shí)也能在昆蟲(chóng)細(xì)胞以及禽類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，且免疫小鼠后，產(chǎn)生的抗體具有中和BVDV2的活性，且具有淋巴細(xì)胞增殖活性，可作為BVDV的候選疫苗。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種廣宿主表達(dá)載體，還涉及基于該載體制備的重組BacMam病毒及其應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，先后出現(xiàn)了許多外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，但上述表達(dá)系統(tǒng)的建立均需要先分別構(gòu)建攜帶目的基因的表達(dá)載體。因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌d體及宿主細(xì)胞的選擇也不相同，表達(dá)載體的選擇也需根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞的不同進(jìn)行調(diào)整，所以導(dǎo)致同一目的基因需要被多次克隆至不同表達(dá)載體中，多次克隆會(huì)導(dǎo)致目的基因突變概率增加，資源的浪費(fèi)，實(shí)驗(yàn)周期的延長(zhǎng)等問(wèn)題出現(xiàn)。經(jīng)濟(jì)易用的廣宿主表達(dá)載體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用具有實(shí)踐上的迫切性。表達(dá)載體通常包括強(qiáng)啟動(dòng)子、正確的轉(zhuǎn)錄起始序列、起始密碼子、終止密碼子、起始復(fù)制位點(diǎn)和抗性篩選標(biāo)記等基本要素，在這些要素中，啟動(dòng)子在表達(dá)載體中起著關(guān)鍵作用，控制著外源蛋白的轉(zhuǎn)錄起始(Difalco等，1997)。由T7啟動(dòng)子控制的pET大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，由CMV啟動(dòng)子控制的動(dòng)物(哺乳類(lèi)、禽類(lèi))細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及由P10啟動(dòng)子控制的昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用較為廣泛的啟動(dòng)子。其中由P10啟動(dòng)子控制的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有強(qiáng)大的載體容量、生物安全性等優(yōu)勢(shì)，無(wú)論是作為表達(dá)載體還是制備疫苗都有廣闊的應(yīng)用前景(Zuidema等，1989)。

桿狀病毒開(kāi)始被認(rèn)為只能感染昆蟲(chóng)細(xì)胞并在昆蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)蛋白，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不具有感染力。直到1983年Volkman等人發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒可以進(jìn)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，之后在1995年Hofmann等以AcMNPV為載體，利用CMV啟動(dòng)子，將BacMam病毒導(dǎo)入人肝細(xì)胞并表達(dá)了報(bào)告基因，1996年Boyce等還證實(shí)由RSV LTR啟動(dòng)子控制的BacMam病毒可以成功的在人和小鼠的細(xì)胞中表達(dá)外源基因。Wang等人2007年證實(shí)利用BacMam病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在肝細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并表達(dá)乙肝表面抗原基因。這些研究結(jié)果證明，在桿狀病毒引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子時(shí)，可以將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)且此種方式已經(jīng)被廣泛應(yīng)用(Philipps等，2005)。BacMam病毒表達(dá)系統(tǒng)屬于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，其特點(diǎn)是病毒直接感染各種細(xì)胞，就能實(shí)現(xiàn)基因在多種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移與表達(dá)(許辰煜等，2004)，具有安全性好、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因、能進(jìn)行翻譯后的加工與修飾(Chamorro等，2016)、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且可抵御補(bǔ)體的滅活(Tani等，2003)等優(yōu)點(diǎn)。由于BacMam病毒操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，且能夠生產(chǎn)具有活性的重組蛋白，因此，BacMam病毒可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大量生產(chǎn)重組蛋白，用于蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的研究。BacMam病毒是一種重組桿狀病毒，通過(guò)直接接種病毒就可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因，但其在昆蟲(chóng)細(xì)胞中只能復(fù)制，不能表達(dá)外源蛋白，外源蛋白的表達(dá)只能在轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中進(jìn)行(Bieniossek等，2012)。

廣宿主表達(dá)載體與BacMam病毒都具有廣闊的應(yīng)用前景，在本發(fā)明中，我們將其整合為一套更為靈活方便的表達(dá)投遞系統(tǒng)。