[發(fā)明專利]一種家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010466632.2
• 申請(qǐng)日: 2020-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111548996A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張恒;宋桂才;薛希娟;李玉鳳;白中平;張艷;王海龍;王靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東諸子生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12N7/00;A61K39/295;A61K39/17;A61K39/145;A61K39/235;A61K39/155;A61K39/245;A61K39/215;A61K39/15;A61K39/12;A61P31/16;A61P31/14;A61P
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

本發(fā)明提供了一種家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的家禽貼壁培養(yǎng)癌細(xì)胞進(jìn)行馴化，經(jīng)過(guò)多代馴化，可實(shí)現(xiàn)每72h正常稀釋傳代，連續(xù)5代保持48h的活細(xì)胞密度翻倍，且活率高于90％，而且隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基越來(lái)越適應(yīng)，比生長(zhǎng)速率繼續(xù)增高，從而獲得家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系。本發(fā)明利用所述家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系可實(shí)現(xiàn)多種家禽病毒的培養(yǎng)，從而以培養(yǎng)得到的病毒作為抗原，滅活后可大規(guī)模制備疫苗，且不同批次間疫苗差異不明顯。本發(fā)明利用所述細(xì)胞懸浮培養(yǎng)抗原雜蛋白含量低，效價(jià)高，內(nèi)毒素含量低，使得抗體滴度明顯高于市售產(chǎn)品。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步及研究和生產(chǎn)的需要，LMH細(xì)胞(雞肝癌細(xì)胞)已逐漸成為使用最頻繁的細(xì)胞系之一。目前，LMH細(xì)胞可用于禽類腺病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒等全病毒的培養(yǎng)及多種蛋白的表達(dá)。隨著高密度細(xì)胞培養(yǎng)容器的推廣及生物制品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)的提高，LMH細(xì)胞培養(yǎng)具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，目前LMH細(xì)胞只能貼壁培養(yǎng)或依附載體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，不管是貼壁培養(yǎng)還是依附載體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在LMH細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基均需要添加高質(zhì)量的進(jìn)口血清，培養(yǎng)基造價(jià)昂貴，且國(guó)產(chǎn)血清很難替代，使得該培養(yǎng)方式的生產(chǎn)成本一直居高不下，對(duì)LMH細(xì)胞培養(yǎng)的放大與推廣造成了一定阻礙。

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗工藝逐漸成為獸用生物制品行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)，目前國(guó)內(nèi)有多個(gè)畜禽疫苗實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備工藝。隨著細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基成本隨之降低，疫苗的批間差降低，疫苗品質(zhì)提高；易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，可降低能耗、培養(yǎng)基、設(shè)備、人工等綜合成本。目前已知的懸浮細(xì)胞，國(guó)內(nèi)除進(jìn)口EB66細(xì)胞(鴨胚干細(xì)胞)外，其余全部為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，沒(méi)有家禽懸浮細(xì)胞系，影響家禽疫苗工藝升級(jí)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，可利用所述家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系規(guī)模化培養(yǎng)禽病毒，從而降低家禽疫苗的生產(chǎn)成本。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系的建立方法，包括以下步驟：(1)將家禽癌細(xì)胞的貼壁細(xì)胞復(fù)蘇，選擇匯合度大于80％的貼壁細(xì)胞消化，將消化細(xì)胞接種至無(wú)血清培養(yǎng)基SF001上；

(2)每24h取樣計(jì)數(shù)一次，當(dāng)計(jì)數(shù)的活細(xì)胞密度大于步驟(1)所述接種的量時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，若48h活細(xì)胞密度高于1.5×10⁶cells/ml，使用所述無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至1.0～1.5×10⁶cells/ml，若48h細(xì)胞密度低于1.5×10⁶cells/ml，靜置沉降后棄去部分上清液，利用所述無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至1.0～1.5×10⁶cells/ml，繼續(xù)培養(yǎng)；

當(dāng)24h取樣計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)數(shù)的活細(xì)胞密度小于步驟(1)所述接種的量時(shí)，靜置沉降棄去部分上清液，使用所述無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至1.0～1.5×10⁶cells/ml后繼續(xù)培養(yǎng)至48h，若48h活細(xì)胞密度高于1.5×10⁶cells/ml，使用所述無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至1.0～1.5×10⁶cells/ml，若48h細(xì)胞密度低于1.5×10⁶cells/ml，靜置沉降后棄去部分上清液，利用所述無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至1.0～1.5×10⁶cells/ml，繼續(xù)培養(yǎng)；

(3)重復(fù)步驟(2)，直至每72h正常稀釋傳代，連續(xù)5代保持48h時(shí)活細(xì)胞密度翻倍且活率高于90％，得家禽癌細(xì)胞無(wú)血清懸浮細(xì)胞系。

優(yōu)選的，步驟(1)所述消化后還包括利用原有含血清培養(yǎng)基終止消化。