[發明專利]光控雜化交聯可降解支架的精細化制造及其骨組織工程應用

有效

• 申請號: 202010466085.8
• 申請日: 2020-05-28
• 公開（公告）號: CN111729129B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 孫勇;樊渝江;蒲小聰;童磊;張興棟
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/12;A61L27/58;C01B25/32;C08H1/00;C08J9/28;B33Y70/10;C08L89/00
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 呂玲

1.一種促進成骨修復光交聯復合3D打印支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，

步驟A. 將GELMA-C以15%w/v的濃度溶于PBS緩沖液中；

步驟B.將光引發劑以5mg/mL的濃度、多巴胺以1mg/mL的濃度、羧甲基纖維素鈉以1wt%的濃度溶于步驟A制得的GELMA-C溶液中，再加入改性HAP-4的羥基磷灰石粉末，使其固含量為82wt%，置勻漿機中充分混合均勻；

步驟C. 將步驟B制得的漿料裝入料筒，將料筒裝入打印系統，采用低溫-光兩步交聯法用于3D生物打印GELMA-C/ HAP-4支架；

步驟D. 將400mg、MW=340kDa的透明質酸（HA）溶于35mLPBS緩沖液中，緩慢加入鹽酸二氯乙烷（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS），直到HA/EDC/NHS的最終摩爾比設定為1:4:2，攪拌30min后，加入1mmol多巴胺，連續監測溶液pH值為5，維持12h，整個反應是在無氧條件下進行的，反應結束后，透析3天進行純化，然后進行凍干，得到白色粉末HA-Dopa；

步驟E. 將步驟D制得的HA-Dopa，紫外輻照4h以上，并用無菌水配置成濃度為20mg/mL的溶液，另取Ⅰ型膠原，用醋酸泡3天以上，配置成濃度為20mg/mL的溶液；

步驟F. 取無菌培養皿，每皿加800μL步驟E配置的HA-Dopa溶液，及800μL步驟E配置的Ⅰ型膠原溶液，另加400μL滅菌水，混勻，再使用不同濃度的酸堿調節pH至7.5，將步驟C打印的支架用75%乙醇滅菌，并用紫外光照射滅菌，放入該培養皿中，將材料裹上水凝膠，皿口用無菌濾膜包好，再蓋上皿蓋，用封口膠封口，保證皿內保持無菌狀態；

步驟G. 將裝有支架的皿放入4℃冰箱冷藏過夜，再放入-20℃冰箱冷凍過夜，取出后放入凍干機中冷凍干燥48 h，得到所需支架；

所述GELMA-C制備方法包括以下步驟：（1）配液：將明膠以10%w/v的濃度溶于PBS緩沖液中，于50℃下充分攪拌至明膠完全溶解；

（2）將甲基丙烯酸酐MA，以每分鐘 0.5mL的速率滴加到步驟（1）制得的明膠溶液中，維持 50℃條件下，充分攪拌反應3h；

該步驟中，甲基丙烯酸酐與明膠之比v/w為：1:1；

（3）反應完成后，將步驟（2）所得產物轉移至離心管中，在1500rpm下離心5min，取上清液，裝入透析袋中；

（4）透析：將步驟（3）所得產物在50℃的純水中透析至少3天，每天換水3次，去除殘留雜質；

（5）用1mol/L NaOH調整步驟（4）所得產物pH為7.5；

（6）將步驟（5）所得產物于-20℃冷凍24h，再放入凍干機冷凍干燥后，得到白色多孔泡沫狀產物，即GELMA-C；

改性HAP-4的羥基磷灰石制備方法包括以下步驟：（1）配液：將乙醇與水按體積比為9:1的比例配置得到溶液，用冰乙酸調其pH值為4.0；

（2）水解反應：取步驟（1）配制的乙醇-水溶液，用磁力攪拌器攪拌，緩慢滴加5 mL正硅酸乙酯與乙烯基三乙氧基硅烷按體積比為1:1配置的溶液，室溫攪拌反應1 h；

（3）縮合反應：向步驟（2）制得的混合溶液中緩慢滴加羥基磷灰石漿料20 mL，室溫攪拌反應1.5h，得混合溶液；

（4）向步驟（3）制得的混合溶液中滴加10wt%的NaOH溶液，調節其pH=10，使步驟（3）中的副產物二氧化硅生成硅酸鹽；

（5）將步驟（4）制得的溶液室溫靜置陳化24h；

（6）將步驟（5）制得的產物分別用無水乙醇和去離子水各洗3遍，以去除未反應完全的正硅酸乙酯與乙烯基三乙氧基硅烷；

（7）將步驟（6）所得產物放入真空干燥箱干燥48h，得到改性HAP-4的羥基磷灰石。

2.根據權利要求1所述一種促進成骨修復光交聯復合3D打印支架的制備方法制得的支架，其特征在于，打印采用三維氣動式打印系統；該系統主要由3D打印機、氣壓擠出機以及藍光光源三部分組成；其中3D打印機由計算機控制 XYZ 三軸精確定位，且料筒處安裝溫度控制器以保證打印材料時具有合適的溫度；溫控打印平臺下安裝了冷卻系統，保證改性HAP-4/GELMA-C水凝膠擠出后能維持穩定的結構；打印時，根據不同的固含量調整打印參數，溫控打印平臺溫度控制在15 ℃～25 ℃，噴頭溫度控制在25 ℃～35 ℃，擠出氣壓控制在0.20 MPa～0.55 MPa，打印速度控制在5 mm/s～15 mm/s。