[發(fā)明專利]一種難溶性多肽的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010465230.0
• 申請(qǐng)日: 2020-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111624287A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐紅巖;秦敬國(guó);李陽(yáng);王國(guó)軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇吉泰肽業(yè)科技有限公司;吉爾生化（上海）有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/74
• 分類號(hào): G01N30/74;G01N30/89
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專利代理有限責(zé)任公司 31113
• 代理人: 張勁風(fēng)

本發(fā)明提供了一種難溶性多肽的檢測(cè)方法，主要解決樣品溶解性差、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明先用異丙醇和乙腈溶解樣品，然后以注入高效液相色譜法分析儀，以C18鍵合硅膠為色譜柱填料，采用紫外檢測(cè)器，選用乙腈、異丙醇和水為流動(dòng)相，三氟乙酸為離子對(duì)試劑，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；流速為1.0ml/min；進(jìn)樣體積為20μl；柱溫為50℃。本方法有效地解決了難溶性多肽的檢測(cè)問(wèn)題，能保證有關(guān)物質(zhì)的可控性，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多肽檢測(cè)，具體涉及一種難溶性肽的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

多肽是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽等。通常由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物都可以成為叫多肽。疏水性多肽指的是富含疏水性氨基酸的多肽。疏水性氨基酸為側(cè)鏈具有高疏水性的氨基酸之總稱氨基酸側(cè)鏈的疏水性，是從各氨基酸的疏水性減去甘氨酸疏水性之值來(lái)表示。如亮氨酸、異亮氨酸、頡氨酸是疏水性的，而賴氨酸、組氨酸、精氨酸是親水性的。難溶多肽主要是其包含的難溶氨基酸引起的，一般來(lái)說(shuō)，難溶氨基酸占多肽比例超過(guò)75％就會(huì)造成多肽的難溶。溶解性是研究蛋白質(zhì)和多肽會(huì)遇到比較重要的問(wèn)題，每個(gè)氨基酸都有其固有的化學(xué)特性。反相高效液相色譜需要將多肽完全溶解到溶劑中，最適合的常規(guī)溶劑為H2O、ACN，這樣才能利用反相高效液相色譜進(jìn)行分析檢測(cè)，但難溶多肽無(wú)法溶解在水/乙腈溶液中，給廣大科研人員在該操作帶來(lái)極大麻煩。

現(xiàn)有解決難溶多肽的方法是選擇優(yōu)良的有機(jī)溶劑(如：DMSO，DMF)去溶解多肽，通過(guò)破壞多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)助溶，會(huì)導(dǎo)致高效液相色譜分離效果大大降低，且對(duì)難容肽鏈的溶解能力有限。

專利CN105001298A是通過(guò)合成路線改變，增加親水基團(tuán)從而達(dá)到溶解的目的。對(duì)于純化有一定幫助，但是并沒(méi)有解決樣品分析檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種難溶性多肽的檢測(cè)方法，主要解決樣品溶解性差、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種難溶性多肽的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

（1）將難溶性多肽粗品溶于溶劑中，超聲至完全溶解，過(guò)濾待測(cè)；

（2）用反相高效液相色譜分析儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)器為紫外；流動(dòng)相A為質(zhì)量百分比：94.9%水,5%乙腈,0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相B為質(zhì)量百分比：94.9%乙腈,5%水,0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相C為質(zhì)量百分比：94.9%異丙醇,5%乙腈,0.1%三氟乙酸；梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；流速為1 .0ml/min；進(jìn)樣體積為20μl；柱溫為50℃。

所述難溶性多肽選自多肽序列為：Pal-VGVAPG、Pal-KTTKS或WILFMVYIIFFW中的一種。

所述步驟（1）溶劑為異丙醇和乙腈。

所述步驟（2）所述反相高效液相色譜分析儀其色譜柱填料為C18鍵合硅膠，粒徑為5μm。

本發(fā)明的有益效果是：通過(guò)三種不同流動(dòng)相的配比，有效地解決了難溶多肽的檢測(cè)問(wèn)題，能保證有關(guān)物質(zhì)的可控性，提高產(chǎn)品質(zhì)量。目標(biāo)峰響應(yīng)值提高10%，分離度大于1.0，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1為Pal-VG-6的粗品分析圖。

圖2為Pal-KS-5的粗品分析圖。

圖3為WW-11的粗品分析圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）序列為：Pal-VGVAPG，將多肽粗品溶于異丙醇和乙腈中，超聲至完全溶解，過(guò)濾待測(cè)；