[發明專利]一種干血片中25-羥基維D的LC-MS/MS高通量檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202010461024.2
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111830146B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發明（設計）人: 栗琳;陸開智;蔡博倫;牛燕燕;肖冰心;潘媛媛;孫念;王黎輝;石浩威;高雅;丁亮;何啟鑫;王校
• 申請（專利權）人: 江蘇豪思睦可生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 吳歡燕

1.一種干血片中25-羥基維D的LC-MS/MS高通量檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、樣品前處理

取樣：取干血斑樣本，用打孔器取3.2毫米濾紙干血片3片加入到96孔U型板中，然后加入200μL甲醇溶液與10μL?10μg/mL?25(OH)D3-¹³C5和25(OH)D2-D3的混合內標溶液渦旋振蕩混勻30min，取180μL上清液至96孔V板中，35-60℃氮氣直至吹干；

衍生：加入50μL衍生劑為4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮的衍生液至吹干后的96孔V板中，渦旋振蕩30min；

終止：加入50μL超純水溶液終止，渦旋振蕩30min，將96孔板V板置于高效液相色譜串聯質譜系統中進行檢測；

S2、采用LC-MS/MS法檢測

高效液相色譜串聯質譜為三重四級桿質譜儀，通過高效液相色譜串聯質譜法測定經所述步驟S1預處理后的樣品檢測溶液；所述步驟S2是采用梯度洗脫反相色譜法分離待測物，利用串聯四級桿質譜儀進行檢測的測定條件包括：

LC條件：Waters?BEH?C18柱；50×2.1mm，填料粒徑1.7μm；柱溫：30～45℃；進樣體積：20～40μL；流動相A：0.5mM乙酸銨水溶液；流動相B：0.5mM乙酸銨甲醇溶液；洗液：弱洗-70％乙腈，強洗-乙腈；所述梯度洗脫的條件包括：

MS條件：離子源：APCI離子源；掃描模式：電噴霧離子源(ESI)和MRM模式；毛細管電壓：3.5KV；離子源加熱溫度：500℃；氣源流速：800L/Hr；其他檢測條件包括：

S3、標準曲線的繪制：配制標準液，以上述LC-MS/MS條件分別檢測所述標準液，并根據檢測結果繪制相應的標準曲線。

2.根據權利要求1所述的干血片中25-羥基維D的LC-MS/MS高通量檢測方法，其特征在于：所述步驟S2中的檢測的目標定量離子對包括25-OHD2衍生化產物和25-OHD3衍生化產物的母離子/子離子檢測對如下所示：25-羥基維生素D3?m/z558.4＞m/z298.2、25-羥基維生素D2?m/z570.4＞m/z298.2；所述步驟S2中檢測的內標衍生化產物的檢測離子對為25-羥基維生素D3內標衍生化產物m/z563.4m/z298.2和25-羥基維生素D2內標衍生化產物m/z573.4＞m/z301.2。

3.根據權利要求1所述的干血片中25-羥基維D的LC-MS/MS高通量檢測方法，其特征在于：所述干血斑樣本包括干血斑標準曲線樣本、質控干血斑樣本和需要檢測的血斑樣本。

4.根據權利要求3所述的干血片中25-羥基維D的LC-MS/MS高通量檢測方法，其特征在于：所述質控干血斑樣本的制備是通過取處理過的全血，分別與30μL、150μL濃度為1μg/mL的25-羥基維生素D混勻至2mL，取75μL滴于濾紙片上，分別獲得15ng/mL和75ng/mL質控干血斑樣本。

5.根據權利要求1所述的干血片中25-羥基維D的LC-MS/MS高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟S3中干血斑標準曲線的制作：取處理過的全血，分別與10μL、20μL、40μL、100μL、160μL、200μL濃度為1μg/mL的25-羥基維生素D混勻至2mL，取75μL滴于濾紙片上，獲得5-100ng/mL干血斑標準曲線樣本，以步驟S2中LC-MS/MS法的測試條件分別檢測所述干血斑標準曲線樣本，并根據檢測結果繪制相應的干血斑標準樣本曲線。