[發明專利]一種維D及其代謝物的質譜檢測用校準和質控品的制備方法

在審

• 申請號: 202010460321.5
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111855832A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 栗琳;翟燕紅;曹正;馬志軍;陸開智;蔡博倫;牛燕燕;肖冰心;潘媛媛;孫念;王黎輝;石浩威;高雅;丁亮;何啟鑫;王校
• 申請（專利權）人: 江蘇豪思睦可生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 廖娜

本發明涉及一種維D及其代謝物的質譜檢測用校準和質控品的制備方法；其包括了空白基質制備，以及維生素D濾紙干血片校準品和質控品的制備過程；本發明制備的濾紙干血片校準品和質控品主要是應用于維生素D串聯質譜法的檢測，具體包括空白血基質的制備、采血量的選擇，濾紙干血片校準品及質控品的制備，干血片樣本量的選擇，本發明提供的校準品和質控品與現有技術相比能更好滿足臨床檢測維D干血片樣本的校準和質量控制的需求。

技術領域

本發明涉及一種維生素D的檢測領域，尤其涉及一種維D及其代謝物的質譜檢測用校準和質控品的制備方法。

背景技術

濾紙干血片(dried blood spot，DBS)采樣法，又稱微量濾紙全血測定法，是使用一次性采血針或毛細管從指間或足跟采血后滴在預先規定好體積的濾紙上，即采集末梢血于濾紙片上，是一種微創采集技術。與傳統的靜脈采血相比，DBS采樣法對樣本采集者的技術要求低，血樣采集的過程被簡化，采血量通常小于100微升，干燥后的樣本具有很好的生物穩定性，可在室溫下儲存和運輸，更適合于嬰幼兒群體的檢測。目前DBS法已廣泛應用在新生兒遺傳疾病篩查、治療藥物監測及藥動力學等領域中。隨著液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)技術對分析靈敏度和重現性的不斷提高，采用LC-MS/MS技術能夠檢測濾紙干血片樣品的25-羥基維生素D含量，非常適合大規模人群樣本的維生素D檢測，尤其便于當地不具備檢測條件的偏遠地區的25-羥基維生素D檢測。

現有方法需采集人體的血清樣本，而嬰幼兒很難采集足量血清，因此現有方法無法滿足嬰幼兒等特殊人群的需求。干血片法采集方便，用血量少，保存簡單，易于運輸，更適合于嬰幼兒群體的檢測。

本發明采用濾紙干血片作為載體，通過空白血基質制備，添加標準溶液后制備濾紙干血斑，得到維D干血斑的校準品和質控品，改善了校準品、質控品和臨床干血斑樣本的基質互通性，可更好的滿足臨床干血斑樣本中維生素D的準確定量。

發明內容

本發明目的在于提供了一種提取率高、提取時間短的維D及其代謝物的質譜檢測用校準和質控品的制備方法。

為了實現上述目的，本發明提供了一種維D及其代謝物的質譜檢測用校準和質控品的制備方法，包括以下步驟：

(1)空白血基質制備：

取健康人抗凝全血，離心后除去上層血漿，加入生理鹽水后得到紅細胞洗滌液,混勻洗滌后,離心，棄上層生理鹽水，重復洗滌多次后得到紅細胞，加入紅細胞稀釋液，混勻后得到空白血基質；

(2)制備維D濾紙干血片校準品：

精密吸取若干份2mL空白血基質，分別加入不同濃度水平的維生素D標準溶液，渦旋混勻后，得到濃度分別為2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的維D校準品中間液，分別取等量體積滴加到濾紙上，待液體擴散后置于平坦干燥處過夜，干燥后即得維D濾紙干血片校準品，密封2-8℃保存；

(3)制備維D濾紙干血片質控品：

精密吸取若干份2mL空白血基質，分別加入不同濃度水平的維生素D標準溶液，渦旋混勻后，得到濃度分別為8ng/ml和40ng/ml的質控品中間液，分別取等量體積滴加到濾紙上，待液體擴散后置于平坦干燥處過夜，干燥后即得維D濾紙干血片質控品，密封2-8℃保存。

(4)維D濾紙干血片校準品和質控品的使用

進一步的，所述步驟(1)的紅細胞洗滌液中生理鹽水的比例為1:1或者1：2或者1：3或者1：4，所述紅細胞與紅細胞稀釋液的比例為1:1或者1:2或者3：2，所述紅細胞稀釋液為含5～15％的BSA的生理鹽水。

進一步的，所述步驟(1)中紅細胞洗滌步驟需用滴管輕輕地反復吹吸混勻，重復洗滌次數為2-4次。