[發明專利]一種非從頭合成的卷枝毛霉產油細胞工廠構建及其發酵技術

在審

• 申請號: 202010455770.0
• 申請日: 2020-05-26
• 公開（公告）號: CN111575301A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 宋元達;孫彩麗;張懷淵;楊武;陳美玲
• 申請（專利權）人: 山東理工大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/80;C12N9/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種高產脂的卷枝毛霉細胞工廠的構建技術，屬于基因工程領域，本發明從卷枝毛霉中克隆獲得二酰甘油酰基轉移酶基因（DGAT），連接至整合型質粒pMAT2075上，轉化到卷枝毛霉缺陷型菌株M65中，通過同源重組將二酰甘油酰基轉移酶基因（DGAT）整合到卷枝毛霉的基因組上，得到重組菌株Mc?DGAT，最終實現了DGAT基因在卷枝毛霉中的表達，重組菌株Mc?DGAT在添加大豆油的培養基中油脂含量與對照菌Mc2075相比變化較大，在表達菌株Mc?DGAT中獲得53%的油脂含量。

技術領域

本發明涉及一種提高脂質積累量的卷枝毛霉細胞工廠的構建技術，屬于基因工程領域。本發明利用同源重組技術在卷枝毛霉WJ11中進行二酰甘油酰基轉移酶基因（DGAT）的過表達，并添加外源油進行發酵，從而構建能夠高產脂的卷枝毛霉細胞工廠。

背景技術

在能夠積累超過自身干重20%的油脂的微生物被稱為產油微生物，其分布比較廣泛，主要有真菌、酵母、細菌和微藻。因為產油真菌卷枝毛霉富含γ-亞麻酸，人們對其的研究越來越深入，卷枝毛霉是全球首次用來工業化生產亞麻酸的菌株，由于其產脂能力強、基因組已被測序且其基因研究體系完善而被用來作為研究微生物生產亞麻酸的模式生物。

多不飽和脂肪酸（PUFAs）只能通過飲食獲得，是人體必需脂肪酸，對人體營養與健康方面均十分有益，因此得到越來越多的人的重視。哺乳動物(包括人類在內)在體內只能合成飽和脂肪酸(SAFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)，而ω-6和ω-3系列多不飽和脂肪酸如亞油酸(LA,18:2,n-6)和α-亞麻酸(ALA,18:3,n-3)均不能在體內合成。亞油酸和亞麻酸經過多種酶催化后可用于合成二十二碳五烯酸(DPA,22:5,n-6)和二十二碳六烯酸(DHA,22:5,n-3)。經研究發現，肥胖、高血壓、糖尿病、冠狀動脈硬化、精神分裂癥及老年癡呆等多種疾病的發生與必需脂肪酸的代謝有關。因此，必需脂肪酸及其衍生物對于人類的健康具有重要意義。

已有研究表明，二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）是三酰甘油合成途徑上的關鍵酶，它是三酰甘油合成最后的一步所需要的酶，能夠催化二酰甘油轉化成三酰甘油。卷枝毛霉中的二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）一共有兩大類，分別是DGATⅠ和DGATⅡ，這兩類均是膜結合蛋白。近幾年，關于卷枝毛霉二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）的研究較多，主要是對其在油脂合成路徑中發揮的作用進行研究，但較多的研究是針對該酶在其他菌株內的異源表達，并且發現表達了該酶的菌株的脂質含量得到提高。然而，關于在卷枝毛霉中內源過表達卷枝毛霉二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）以提高其脂質積累量的研究并不多見。

本研究室前期研究發現一株油脂積累量能夠達到36%的卷枝毛霉，其細胞內脂肪酸組成中的γ-亞麻酸含量為18-19%，而且其發酵條件可控性高。因此，本研究根據該菌種的優勢條件，將來源于卷枝毛霉的二酰甘油酰基轉移酶（DGAT），通過同源重組的基因工程方法來在卷枝毛霉中進行內源表達，構建能夠高產脂質的細胞工廠，為大力推廣卷枝毛霉的工業化應用提供指導。

發明內容

本發明提供一種卷枝毛霉重組菌株Mc-DGAT，來源于卷枝毛霉的二酰甘油酰基轉移酶（DGAT），在卷枝毛霉基因組上的進行整合表達，與對照菌Mc2075相比，其脂質含量有所提高，且其脂肪酸組成有所改變，優化發酵條件后脂質含量可達細胞干重的53%。

本發明的技術方案是：提取卷枝毛霉菌株的mRNA反轉出cDNA，設計特異引物PCR擴增二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）（其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），將該基因連接至整合型質粒pMAT2075上，然后將該重組質粒電轉化到卷枝毛霉缺陷型菌株M65的原生質體中，挑選陽性克隆進行發酵培養，發酵條件為：采用Kendrick或改進的Kendrick培養基，并外源添加大豆油作為碳源，于28℃，700 rpm，進氣量1 v/v min^-1，pH 6.0的條件下進行發酵。發酵過程中，根據油脂積累規律采集樣品，進行油脂含量與組成的測定。