[發明專利]GGPPS定向單點突變蛋白GGPPS-161

有效

• 申請號: 202010452561.0
• 申請日: 2020-05-26
• 公開（公告）號: CN111534497B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 王燃;董臣;魏攀;金立鋒;李鋒;都菲;楊寧寧;馮明星;徐韶妍;毛佳琪
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/82;C12P23/00;A01H5/00;A01H6/82;A01H6/46;A01H6/74;A01H6/34;A01H6/00;A01H6/78;A01H6/88;A01H6/14
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 張曉萍

本申請屬于煙草基因工程技術領域，具體涉及GGPPS定向突變蛋白。現有GGPPS蛋白的154、161和218這三個位點位于酶的催化口袋，209和233這兩個位點位于酶分子表面；基于這五個位點，本申請提供了GGPPS系列定向突變蛋白，其中包括：系列單位點突變蛋白、雙位點突變蛋白、三位點突變蛋白、四位點突變蛋白、五位點突變蛋白。發明人利用CAST技術構建“小而精”的突變體文庫，通過進一步篩選以及基于定向進化需要，發明人對特定位點氨基酸突變類型做了詳細分析。初步實驗結果表明，特定位點氨基酸突變后，β?胡蘿卜素合成量得到了明顯提高，為進一步作物新品種培育奠定了一定技術基礎。

技術領域

本申請屬于煙草基因工程技術領域，具體涉及GGPPS定向突變蛋白專利申請事宜。

背景技術

類胡蘿卜素是一種重要的質體色素，具有重要的生理作用，與植物的生長發育和光合作用密切相關，影響作物品質性狀。牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)是類胡蘿卜素、葉綠素和維生素E的植醇側鏈、赤霉素以及二萜植保素的共同前體。GGPP由牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶(GGPP synthase, GGPPS)催化產生，3分子異戊烯基焦磷酸（IPP）和1分子烯丙基異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，在GGPPS的作用下縮合生成C20的GGPP。

GGPP是類胡蘿卜素合成的起始底物，能夠被類胡蘿卜素合成通路的端口酶八氫番茄紅素(phytoene)合酶(phytoene synthase，PSY)催化形成八氫番茄紅素，用于合成類胡蘿卜素。對植物GGPPS基因家族的大量研究例證表明，該家族成員不僅編碼萜類合成通路上游的重要酶蛋白，而且還直接參與調控植物萜類合成的各個通路，在調控方面發揮著核心作用。

現有研究中，對于類胡蘿卜素合成途徑雖然已有較多研究，但從植物改造角度而言，如果能夠利用基因工程技術實現定向化的選育和培育，是實現植物最大化利用的重要技術前提。

作為合成生物學的關鍵性技術之一，定向生物進化技術獲得了2018年諾貝爾化學獎。該技術廣泛用于酶的活性設計，通過定向進化，可有效克服天然酶在環境耐受性、立體/區域選擇性、底物特異性、催化效率及產物抑制性等方面存在的缺點，使得自然界成千上萬年的進化歷程在實驗室內較短時間完成。

在酶的定向進化技術發展過程中，傳統定向進化時，如利用易錯 PCR、DNA混組、序列飽和突變、隨機引發體外重組等技術時，存在突變效率低、篩選工作量大等缺點，制約了酶分子的體外定向進化的應用。組合活性中心飽和突變策略 (Combinatorial active-site saturation test，CAST) 則是一種較新的定向進化突變策略，該技術基于蛋白的結構信息，首先借助計算機的模擬基礎，隨后在酶催化活性中心周圍選取與底物有直接相互作用的氨基酸殘基，通過構建“小而精”的突變體文庫，從而減少突變體文庫的篩選規模。

總體上，雖然定向進化技術可以加快作物基因的進化歷程，為作物品質的改良提供優質基因，但由于發展時間較短，且存在其他技術難題，因此目前定向進化技術仍未用于植物基因的改造。

煙草作為基因工程研究的模式作物之一，同時煙草內類胡蘿卜素含量直接影響了煙草的品質性狀。因此，如能結合定向進化對煙草萜類合成基因進行定向改造，對于加快煙草育種具有十分重要的應用意義，同時也可為其他作物的遺傳育種奠定一定技術基礎。

發明內容

通過對牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶(GGPP synthase，GGPPS)酶結構研究，結合定向進化技術，本申請目的在于提供若干具有更好酶活的GGPPS及煙草GGPPS基因，從而為煙草育種、煙草新品種培育提供一種新的技術思路，同時也為其他作物育種和品種改良奠定一定技術基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。