[發(fā)明專(zhuān)利]表達(dá)HLA-G6異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)蛋白的細(xì)胞株及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010452502.3
• 申請(qǐng)日: 2020-05-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111647562A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏衛(wèi)華;林愛(ài)芬;許惠惠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10;C12N15/85;G01N33/96;C12R1/91
• 代理公司: 浙江杭州金通專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發(fā)明提供了表達(dá)HLA?G6異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)蛋白的細(xì)胞株，保藏機(jī)構(gòu)為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC NO:C202016。其能夠穩(wěn)定表達(dá)HLA?G6異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)蛋白，能在人類(lèi)白細(xì)胞抗原?G異構(gòu)體分子HLA?G6流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡、組織及細(xì)胞免疫組化、HLA?G異構(gòu)體功能研究及特異性抗體開(kāi)發(fā)篩選作為標(biāo)準(zhǔn)參照物等應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及已知7種人類(lèi)白細(xì)胞抗原-G(HLA-G) 異構(gòu)體分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，可作為特定HLA-G異構(gòu)體分子(HLA-G1、-G2、-G3、 -G4、-G5、-G6及HLA-G7)流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡、組織及細(xì)胞免疫組化、HLA-G 異構(gòu)體功能研究及特異性抗體開(kāi)發(fā)篩選作為標(biāo)準(zhǔn)參照物等應(yīng)用。

背景技術(shù)

人類(lèi)白細(xì)胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因，全長(zhǎng)6.0kb，位于人類(lèi)第6號(hào)染色體短臂遠(yuǎn)側(cè)6p21.3。在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中，HLA-G mRNA 第1外顯子編碼信號(hào)肽，第2、3和第4外顯子分別編碼細(xì)胞外區(qū)的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域，第5位外顯子編碼跨膜區(qū)；第6外顯子編碼僅含6個(gè)氨基酸殘基的 HLA-G分子胞內(nèi)段；由于外顯子6內(nèi)含有終止密碼子，第7外顯子不被轉(zhuǎn)錄；第8外顯子對(duì)應(yīng)于HLA-G基因的3′UTR。

HLA-G初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)選擇性剪接，可產(chǎn)生7種成熟mRNA，分別編碼7 種不同分子量的異構(gòu)體分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)。 HLA-G1是由全長(zhǎng)HLA-G mRNA編碼，結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于HLA Ia抗原分子。HLA-G2 缺乏α2結(jié)構(gòu)域；HLA-G3缺乏α2和α3結(jié)構(gòu)域；HLA-G4缺乏α3結(jié)構(gòu)域； HLA-G5及HLA-G6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域分別與HLA-G1及HLA-G2相同，但它們由含有內(nèi)含子4的HLA-G mRNA編碼，因內(nèi)含子4中含有終止密碼子，所編碼的蛋白分子缺乏由外顯子5所編碼的跨膜區(qū)，形成可溶性HLA-G分子。編碼 HLA-G7的mRNA由于內(nèi)含子2中含有終止密碼子，胞外區(qū)僅含α1結(jié)構(gòu)域及由內(nèi)含子2所編碼的2個(gè)氨基酸殘基相連(圖1)。HLA-G1～-G7異構(gòu)體分子的分子量分別為39kD、31kD、23kD、30kD、37kD、27kD及16kD。

生理情況下，HLA-G分子僅表達(dá)在母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，在維持母胎免疫耐受中起重要作用。病理情況下，HLA-G分子能在多種腫瘤細(xì)胞及病毒感染等組織細(xì)胞中誘導(dǎo)性表達(dá)，與疾病的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。目前已廣泛認(rèn)同HLA-G分子是體內(nèi)一個(gè)重要的免疫致耐分子，其免疫抑制功能主要通過(guò)結(jié)合免疫抑制性受體免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物-2(immunoglobulin-like transcript-2, ILT2/LILRB1/CD85j)、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物-4(ILT4/LILRB2/CD85d),傳遞抑制信號(hào)，誘導(dǎo)免疫耐受。具體作用機(jī)制有：①與表達(dá)在T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B 細(xì)胞上的ILT2結(jié)合，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞免疫殺傷活性，及B細(xì)胞增殖和抗體分泌等功能。②與樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)上的ILT2、ILT4結(jié)合，抑制DC細(xì)胞的成熟和分化，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性DC細(xì)胞。③與骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞(MDSC) 和巨噬細(xì)胞(Mφ)上的ILT2、ILT4結(jié)合，誘導(dǎo)促炎抗腫瘤的M1向免疫致耐性 M2細(xì)胞分化。因此，HLA-G分子是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的免疫耐受分子。

此外，HLA-G與受體ILT2、ILT4結(jié)合，具有分子結(jié)構(gòu)特異性。受體ILT2、 ILT4與HLA-G結(jié)合的位點(diǎn)HLA-G胞外區(qū)α3結(jié)構(gòu)域。ILT2僅結(jié)合HLA-G/β2m 復(fù)合物，而ILT4不僅可以與HLA-G/β2m結(jié)合，同時(shí)可以與不含β2m的游離 HLA-G分子結(jié)合。由于HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7在表達(dá)機(jī)制及分子結(jié)構(gòu)上存在差異，如HLA-G3、-G4、及HLA-G7不含α3結(jié)構(gòu)域，不能與ILT2和ILT4結(jié)合。因此，不同HLA-G異構(gòu)體分子可在病理生理過(guò)程中發(fā)揮特定的免疫學(xué)效應(yīng)。