[發明專利]合成2’-巖藻糖基乳糖的重組大腸桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010450707.8
• 申請日: 2020-05-25
• 公開（公告）號: CN111575220B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;堵國成;李江華;呂雪芹;林璐
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種合成2'?巖藻糖基乳糖的重組大腸桿菌及其構建方法與應用，屬于代謝工程技術領域。本發明通過在大腸桿菌MG1655的鞭毛驅動蛋白基因fliR位點整合外源α?1,2?巖藻糖基轉移酶的基因，進一步將巖藻糖激酶的基因敲入至大腸桿菌MG1655基因組L?墨角藻糖激酶基因fuck位點，并敲除大腸桿菌MG1655上乳糖操縱子中的轉錄阻遏物基因lacI，獲得了可高效合成2'?FL的無質粒工程菌株，其胞內胞外總量達到806.2mg/L。

技術領域

本發明涉及一種合成2'-巖藻糖基乳糖的重組大腸桿菌及其構建方法與應用，屬于代謝工程技術領域。

背景技術

人乳低聚糖(Human?milk?oligosaccharides,HMOs)是一類構成母乳特有的復合碳水化合物，通過刺激新生兒中有益腸道細菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長，平衡腸道菌群的發育可能對調節新生兒出生后免疫系統起重要作用，作為先進嬰兒配方食品的功能性成分非常重要。此外，HMOs可以抑制病原體與上皮細胞表面聚糖的粘附，從而限制一些病原體的毒力。根據組成HMOs的單糖結構單元，HMOs可分為中性巖藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖和中性非巖藻糖基化乳糖三種。在多種HMOs寡糖結構類別中，大約50％的HMOs是巖藻糖基化的，而2'-巖藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose,2'-FL)是目前最具有潛力的一種巖藻糖基乳糖，已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準為安全的食品添加劑，可作為高檔嬰幼兒配方食品中的營養添加劑。巖藻糖基化的2'-FL可通過α-1,2-巖藻糖基轉移酶，以GDP-L-巖藻糖(GDP-L-fucose,GDP-L-Fuc)為供體、乳糖為底物催化合成。

目前，2'-FL的生產方法主要有化學合成法、酶合成法和生物合成法。在化學合成法中，由于使用高濃度的有毒試劑，會對環境造成一定的污染。在酶法合成中，2'-FL的催化合成需要昂貴的GDP-L-Fuc前體試劑，這大幅增加了生產成本。而生物合成法是利用細菌合成GDP-L-Fuc前體，并在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的作用下，以環境友好的方式自身代謝合成2'-FL。因此，生物合成法具有更好的工業應用前景，并受到越來越多研究者的青睞。例如，研究者利用巖藻糖補救途徑可以實現在釀酒酵母(Saccharomyces?Cerevisiae)中合成2'-FL，但由于釀酒酵母的發酵周期較長，限制了其在工業生產的廣泛應用。

大腸桿菌MG1655能夠內源性地合成2'-FL的前體物質GDP-L-Fuc，在外源α-1,2-巖藻糖基轉移酶和底物乳糖的催化作用下合成巖藻糖基化的2'-FL(如圖1所示)。然而，在以葡萄糖或甘油為碳源的內源性從頭合成途徑中，GDP-L-Fuc同時也是合成莢膜異多糖酸的中間體。因此，2'-FL的合成前體GDP-L-Fuc容易被其他競爭途徑所消耗，導致大腸桿菌MG1655合成2'-FL所需的前體GDP-L-Fuc的含量非常有限。雖然在目前研究中，多種策略包括過表達與輔因子相關酶的基因、刪除代謝競爭途徑上的相關基因等，被用來提高2'-FL的產量，但這些方法構建的質粒容易對菌體造成一定的代謝負擔，從而使細胞在生產過程中容易出現質粒丟失的情況。因此，為在發酵過程中產生更穩定的工程菌株，可以將與2'-FL和GDP-L-Fuc合成相關的基因敲入到大腸桿菌的基因組上，以構建生產2'-FL的無質粒重組大腸桿菌。但是目前整合到基因組上構建的菌株合成2'-FL的產量較低，不能適用于工業化生產。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種合成2'-巖藻糖基乳糖的無質粒重組大腸桿菌，通過在大腸桿菌MG1655的鞭毛驅動蛋白基因fliR位點整合外源α-1,2-巖藻糖基轉移酶的基因，進一步將巖藻糖激酶的基因敲入至大腸桿菌MG1655基因組L-墨角藻糖激酶基因fuck位點，并敲除大腸桿菌MG1655上乳糖操縱子中的轉錄阻遏物基因lacI，獲得了可高效合成2'-FL的無質粒工程菌株，其胞內胞外積累總量達到806.2mg/L。