[發(fā)明專利]一種谷氨酸脫羧酶突變體、基因及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010442372.5
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111607583B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃俊;花雨嬌;梅樂和;陳貴才;呂常江;胡升;趙偉睿;胡偉蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江科技學院
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發(fā)明公開了一種谷氨酸脫羧酶突變體、基因及應(yīng)用。所述谷氨酸脫羧酶突變體由野生型谷氨酸脫羧酶第54位氨基酸殘基由天冬氨酸突變?yōu)楸彼崴谩１旧暾埻ㄟ^優(yōu)化蛋白表面電荷方法對蛋白質(zhì)進行改造，并結(jié)合定點突變技術(shù)，得到了催化性能更高的GAD突變體。與野生型相比，突變體D54A的k_cat/K_m是野生型的1.80倍，t_1/2是野生型的14.76倍，T₅₀¹⁵和T_m分別比野生型提高3.95℃和4.80℃。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種谷氨酸脫羧酶突變體、基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)

GABA(γ-Aminobutyric acid或γ-Aminobutanoic acid，簡稱GABA)是一種有生物活性的化合物，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳達物質(zhì)，具有預防癌癥、減緩心血管疾病、抗驚厥、降血壓、鎮(zhèn)靜安神、醒酒等作用。此外，GABA可用于合成N-吡咯烷酮和尼龍4，在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD；EC 4.1.1.15)是利用生物法制備GABA的關(guān)鍵酶。在輔酶PLP存在下，GAD可專一性地催化L-谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)脫去α-羧基生成GABA。由于天然的GAD催化效率低和穩(wěn)定性差等缺點，在工業(yè)上的應(yīng)用有限。因此，提高GAD的催化性能對其在工業(yè)上的應(yīng)用有重要的意義。

大多數(shù)蛋白表面殘基在進化過程中不保守，對酶的催化性能有重要的微調(diào)作用。蛋白質(zhì)表面帶電殘基的改變可能引起蛋白活性部位周圍的靜電場發(fā)生改變，從而使酶的催化性能發(fā)生改變。研究表明，優(yōu)化蛋白質(zhì)表面電荷是一種提高酶催化性能的有效策略，該方法通過預測酶蛋白表面電荷-電荷間相互作用能，將蛋白表面不利于酶催化性能的帶負電荷的殘基替換為中性或帶正電荷的殘基以提到其催化性能。Schweiker等(Schweiker KL,Zarrine-Afsar A,Davidson AR,etal.Computational design of the Fyn SH3 domainwith increased stability through optimization of surface charge chargeinteractions[J].Protein Science.2007；16(12):2694-702.)使用TK-SA模型合理優(yōu)化Fyn SH3結(jié)構(gòu)域表面電荷間相互作用能，成功地提高了該蛋白的穩(wěn)定性，最穩(wěn)定突變體的熱解折疊溫度(T_m)比野生型高12.3℃。Zhang等(Zhang LJ,Tang XM,Cui DB,etal.A methodto rationally increase protein stability based on the charge–chargeinteraction,with application to lipase LipK107[J].Protein Science.2014；23(1):110-6.)通過改進TK-SA模型算法，發(fā)布了一套新的設(shè)計算法-ETSS，運用ETSS算法預測位于脂肪酶Lipk107表面且對酶的穩(wěn)定性至關(guān)重要4個殘基(D113、D149、D213和D253)，利用酸性或中性氨基酸對4個位點的氨基酸進行替換得到4個Lipk107突變體(D113A、D149K、D213A和D253A)，研究結(jié)果顯示，突變體D113A、突變體D149K、突變體D213A和突變體D253A在50℃下的半衰期(t_1/2)分別是野生型的12倍、14倍、4.5倍和6倍，且突變體D253A的酶活力是野生型的1.2倍。Tu等(Tu T,Luo H,Meng K,etal.Improvement in thermostability of anAchaetomium sp.strain Xz8endopolygalacturonase via the optimization ofcharge-charge interactions[J].Applied and Environmental Microbiology.2015；81(19):6938-44.)利用ETSS程序計算了多聚半乳糖醛酸酶帶電氨基酸i點和j之間的總相互作用能(E_ij)，推斷出影響酶蛋白穩(wěn)定性的9個殘基，利用定點突變構(gòu)建9個突變體，研究表明，突變體D244A和突變體D299R表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性；雙突變體D244A/D299R的半失活溫度(T₅₀)和T_m分別比野生型提高17℃和10.2℃，其在50℃和55℃的t_1/2分別比野生型延長8.4h和45min。