[發明專利]堿性成纖維細胞生長因子的提取方法

在審

• 申請號: 202010440708.4
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111454348A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 王躍駒
• 申請（專利權）人: 王躍駒
• 主分類號: C07K14/50
• 分類號: C07K14/50;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發明涉及生物技術領域，特別涉及提取堿性成纖維細胞生長因子的方法。特別是從水稻、生菜、煙草等植株中工業化提取高純度堿性成纖維細胞生長因子。通過該法可以實現堿性成纖維細胞生長因子穩定的產業化提取，廣泛適用于各種材料來源。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及提取堿性成纖維細胞生長因子的方法。

背景技術

早在1940年，Hoftman等在腦和垂體的抽提物中發現一種能夠促進成纖維細胞生長的物質。該物質1974年被命名為成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)。因對酸和熱敏感，等電點呈堿性(pI＝9.6)，又被稱之為堿性FGF(bFGF，或FGF-2)。后來人們發現成纖維細胞生長因子(FGFs)包含一個大的家族，其均參與細胞生長和分化，并且在無脊椎動物和脊椎動物中廣泛存在。成纖維細胞生長因子家族中被研究最透徹的兩個成員是酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)以及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。先發現的bFGF和aFGF(FGF-1也稱為內皮細胞生長因子，等電點為酸性，pI＝5.6)與后發現的FGF-5、FGF-6、角質細胞生長因子(KGF/FGF-7)、hst-1/kfgf、int-2等同屬于FGF家族，該家族共同特點是由35-55％氨基酸序列保守性的蛋白質組成。與其他家族成員不同，aFGF和bFGF缺乏信號肽。

bFGF是含155個氨基酸的促有絲分裂的堿性蛋白質，其氨基酸序列與aFGF有55％的同源性，但其生物學活性比aFGF強30-100倍。bFGF分子量為16～18.5KD。bFGF分子結構中有4個半胱氨基酸(Cys)，用絲氨酸取代半胱氨酸，bFGF的生物學活性不變，更容易在大腸桿菌中表達。

bFGF成熟肽的羧基端較氨基端更穩定，將氨基端截去24個氨基酸時，尚不影響其生物學活性。bFGF在生物進化上具有很強的保守性，人和牛的bFGF蛋白同源性達98.7％。bFGF主要分布于腦垂體、腦和神經組織及視網膜、腎上腺、胎盤等部位，可以由內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞分泌。以垂體組織含量最高，每公斤垂體組織可純化bFGF 0.5mg，其它組織含量很少，約為其1/10～1/50。bFGF不存在或以極低濃度存在于血清和體液中。

bFGF作為細胞分裂原，它的作用是促進內皮細胞的游走和平滑肌細胞的增殖，不能使平滑肌細胞游走。能夠促進新血管形成，修復損害的內皮細胞。另外，bFGF對神經損傷修復也有顯著地促進作用，對來源于中胚層和神經外胚層的多種細胞(骨骼肌細胞、成纖維細胞和骨細胞等)具有增殖和分化刺激調節作用，對神經系統的發育和生長也有廣泛的促進作用，尤其是在周圍神經受損傷后。bFGF的神經再生促進作用體現在：一方面對神經元細胞有保護作用，對神經膠質細胞(包括施旺細胞和衛星細胞)有促分裂增殖作用，另一方面促進神經纖維再生和血管發生，并改善微循環。

FGF存在兩類受體：一類是親和力受體，屬跨膜性酪氨酸蛋白激酶類受體；另一類是低親和力受體，即肝素樣受體，為硫酸乙酰肝素蛋白多糖類物質。bFGF通過與靶細胞上的受體結合而發生作用，因此細胞內合成的bFGF需分泌至細胞外才能發揮生物學效應。但bFGF的mRNA翻譯產物缺少引導它們向細胞外分泌的信號序列，其分泌途徑與經典途徑不同，除了可能是細胞受損或死亡后釋出，還有自分泌和旁分泌起作用。

目前，成纖維細胞生長因子在現代臨床醫學及外科手術和美容手術中發揮著不可估量的作用，而且可以快速修復燒傷、刮傷、燙傷、摔傷等新鮮創面，表現出了極大的商業價值。在過去幾十年中，包括重組腺相關病毒(rAAV)，大腸桿菌，畢赤酵母，昆蟲細胞，哺乳動物細胞和轉基因植物在內的幾種表達系統試圖產生重組FGF。然而，表達的不溶性，產量低，復雜加工和低生物活性嚴重限制了其應用。