[發明專利]一種馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測方法

在審

• 申請號: 202010439243.0
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111560450A
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 趙偉全;于秀梅;楊德潔;郭巍;趙丹;劉大群
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/465
• 代理公司: 北京久維律師事務所 11582
• 代理人: 杜權

本發明公開了一種馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測方法，根據馬鈴薯瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇的基因txtA和txtB等序列設計引物，通過線上篩選與擴增效果篩選，得到一組LAMP檢測引物；再對反應體系進行優化以及特異性驗證建立了馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測方法并測定其靈敏度。應用此方法對提取馬鈴薯瘡痂病組織以及帶有瘡痂病菌的土壤DNA對建立LAMP檢測方法進行穩定性驗證，得出本發明LAMP檢測引物提高了病原菌檢測的靈敏度以及檢測效率，為以后預防馬鈴薯瘡痂病的工作奠定了基礎，對馬鈴薯瘡痂病的預防有較高的實際應用價值。

技術領域

本發明涉及馬鈴薯瘡痂病菌檢測技術領域，具體為一種馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測方法。

背景技術

馬鈴薯瘡痂病(Potato common scab)是馬鈴薯生產中的重要土傳和種傳病害，目前在世界各馬鈴薯種植區普遍發生，造成該病的病原菌包括多種植物病原鏈霉菌，可在土壤中習居生活，隱蔽性較強，主要通過田間機械操作和帶病種薯進行傳播，由于該病主要危害馬鈴薯植株的地下部位，早期不易被發現，而到病薯有明顯的癥狀表現時已經很難防控，從而造成大量損失，為了能有效快速檢測瘡痂病原菌的存在情況，通過篩選通用特異性檢測引物和反應體系建立了瘡痂病菌的快速檢測方法很有必要。

對馬鈴薯瘡痂病菌基因組的深入研究發現合成毒素的致病基因聚集在一個大的染色體區域，作為一個致病島存在于鏈霉菌中，包含txtA、txtB、txtC、txtD等多個基因。瘡痂病菌的致病性是和致病島密切相關的。致病島包含了比較大的染色體區域(10-200kb)，僅僅出現在致病株的染色體中，而在非致病株不存在]。引起瘡痂病的thaxtomin A的生物合成是在瘡痂病致病種的單基因座(txt)上，txtA和txtB編碼合成的4-硝基吲哚和L-苯丙氨酸具有甲基化和環化二肽合成酶的功能。

發明內容

本發明的目的在于提供一種馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測方法，利用LAMP檢測方法篩選到了擴增結果穩定，可以作為LAMP檢測引物的B3B3/B3F3、B3FIP/B3BIP、B3LF/B3LB，從而提高了病原菌檢測的靈敏度以及檢測效率，為以后預防馬鈴薯瘡痂病的工作奠定了基礎，對馬鈴薯瘡痂病的預防有較高的實際應用價值，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測方法，包括以下步驟：

S1：根據馬鈴薯瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇的基因txtA和txtB序列設計引物，通過線上篩選與擴增效果篩選，得到一組LAMP檢測引物；

S2：對反應體系進行優化以及特異性驗證，并測定馬鈴薯瘡痂病菌的LAMP檢測靈敏度；

S3：對提取馬鈴薯瘡痂病組織以及帶有瘡痂病菌的土壤DNA建立LAMP檢測的穩定性驗證。

更進一步地，S1中的具體方法如下：

S101：使用PrimerExplorer在線LAMP引物設計軟件針對馬鈴薯瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇的基因txtA和txtB序列設計引物；

S102：所設計的每組引物共包括六條引物，分別為兩條內引物、兩條外引物和兩條環引物，再對引物進行合成；

S103：根據試劑盒說明書，以CPS-1的DNA為模板，在初始反應體系下對所合成引物進行篩選，在65℃條件下反應30-60min進行等溫擴增，80℃滅活10min；

S104：擴增結束后取5μL擴增產物用1.6％瓊脂糖凝膠110V、35min電泳檢測，同時在其余20μL擴增產物中加入0.15μL熒光染料觀察顏色變化，若有目的片段大量擴增，則反應管呈熒光綠色，反之則呈染料本身顏色橙色。

更進一步地，S1中的LAMP檢測引物為B3B3/B3F3、B3FIP/B3BIP、B3LF/B3LB。