[發明專利]一種礬根叢生芽超低溫保存及恢復培養方法

有效

• 申請號: 202010438958.4
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111513061B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 林田;殷麗青;騰小英;李天菲;韓靜;周麗;楊華;劉鴻艷;龍萍;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種礬根叢生芽的超低溫保存方法，其特征在于，所述方法由如下步驟組成：

S1、無菌系的建立與增殖：礬根莖基部組織經消毒后，接種在含6-BA 2.0mg/L、NAA0.1mg/L的MS培養基上，20-40d后形成叢生芽；將叢生芽分割成單芽，轉接于含6-BA 0.1mg/L的MS培養基上進行增殖培養；

S2、葉片叢生芽誘導：取4-7mm的無菌組培苗葉片，背面向上放入含6-BA 2.0mg/L，NAA0.1mg/L的MS培養基中，15-30天誘導出0.5-1.5mm的叢生芽；

S3、叢生芽預培養：將叢生芽帶葉基盤轉入含蔗糖的MS培養基培養1-3天；所述含蔗糖的MS培養基中含蔗糖0.3mol/L；

S4、叢生芽的機械固定:用鑷子將帶叢生芽的葉基盤串連到滅菌過的12-15mm大頭針上,每根針串連3-8片葉基盤，組成葉基盤串；

S5、叢生芽裝載及玻璃化處理：將叢生芽葉基盤串放于預處理溶液中裝載1hr后轉入玻璃化保護劑PVS2中進行20-60分鐘的冰浴處理；所述預處理溶液為MS培養基+1.2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖；

S6、冷凍：將叢生芽葉基盤串迅速投入液氮中凍存。

2.根據權利要求1所述的礬根叢生芽的超低溫保存方法，其特征在于，步驟S1中，增殖培養的培養溫度24±2℃，光照強度為30-35μmol·m^-2·s^-1，光照時間為10-12h/d，每20-40d繼代1次。

3.一種采用如權利要求1所述方法超低溫保存后的礬根叢生芽的恢復培養方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

A1、解凍洗滌：取出凍存的叢生芽葉基盤串，在35-40℃水浴中解凍60-90S后在1.2M蔗糖MS液體培養基洗滌15-20分鐘；

A2、恢復培養：用鑷子將帶叢生芽的葉基盤由葉基盤串分離，在無菌濾紙上吸干，并在體視顯微鏡下逐一將叢生芽與葉片基部組織剝離，將叢生芽接種到恢復培養基上，黑暗培養7天后轉到正常光照培養。

4.根據權利要求3所述的恢復培養方法，其特征在于，步驟A1中，所述1.2M蔗糖液體培養基為1/2MS培養基+1.2mol/L蔗糖。

5.根據權利要求3所述的恢復培養方法，其特征在于，步驟A2中，所述恢復培養基為1/2MS培養基+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+GA₃0.5mg/L。

6.根據權利要求3所述的恢復培養方法，其特征在于，步驟A2中，所述黑暗培養的參數為培養溫度24±2℃，光照強度為0μmol·m^-2·s^-1；所述光照培養的參數為培養溫度24±2℃，光照強度為30-35μmol·m^-2·s^-1，光照時間為12h/d。