[發明專利]程序化框架gRNA及其應用

有效

• 申請號: 202010438038.2
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111613272B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 陸志科;馬麗佳;宋慶凱
• 申請（專利權）人: 西湖大學
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B50/30
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 陳曉娜

1.一種程序化框架gRNA，與親本框架gRNA相比，所述程序化框架gRNA在Tetraloop、Loop2和Tail中的任一結構中引入腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列修飾，其中所述腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列選自SEQ ID No：1-9中的任一項。

2.根據權利要求1所述的程序化框架gRNA，其中所述修飾為替換或插入，具體地，在Tetraloop和Loop2中的修飾為替換，即，用A/G混合捕獲序列替換Tetraloop或Loop2，在Tail中的修飾為插入，即，在Tail中插入A/G混合捕獲序列，更具體地，在Tail的polyT之前插入腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列。

3.根據權利要求1所述的程序化框架gRNA，其中所述腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列的5’端和/或3’端帶有接頭序列。

4.根據權利要求1所述的程序化框架gRNA，其中所述腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列選自SEQ ID No：1、3或7。

5.一種構建權利要求1-4中任一項所述的程序化框架gRNA的方法，所述方法包括在親本框架gRNA的Tetraloop、Loop2或Tail的任一個中引入腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列，其中腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)混合捕獲序列選自SEQ ID No：1-9中的任一項。

6.包含權利要求1-4中任一項所述的程序化框架gRNA的載體。

7.一種gRNA表達盒，其在5’至3’方向依次包含啟動子、tRNA和程序化框架gRNA，其結構如式I所示，其中在啟動子3’末端與程序化框架gRNA的5’末端(更具體地，為spacer序列的5’末端)之間添加tRNA：

其中從左至右為5’至3’方向，程序化框架gRNA表示權利要求1-4中任一項所述的程序化框架gRNA。

8.根據權利要求7所述的gRNA表達盒，其中所述啟動子為Pol III啟動子或Pol II啟動子，優選Pol III啟動子，更優選U6啟動子，最優選人U6啟動子。

9.根據權利要求7所述的gRNA表達盒，其中所述tRNA選自人tRNA(Gln)(SEQ ID No：14)或水稻tRNA(Gly)(SEQ ID No：15)。

10.根據權利要求7所述的gRNA表達盒，其中所述啟動子為U6啟動子，并且所述tRNA選自人tRNA(Gln)(SEQ ID No：14)或水稻tRNA(Gly)(SEQ ID No：15)。

11.包含權利要求7-10中任一項所述的gRNA表達盒的載體。

12.一種雙gRNA表達盒，其在5’至3’方向包含啟動子、框架gRNA、tRNA和程序化框架RNA，其中tRNA序列位于框架gRNA與程序化框架gRNA之間，所述雙gRNA表達盒的結構如式II所示：

其中從左至右為5’至3’方向，框架gRNA表示未經A/G混合捕獲序列修飾的框架gRNA，程序化框架gRNA表示權利要求1-4中任一項所述的程序化框架gRNA。

13.根據權利要求12所述的雙gRNA表達盒，其中所述啟動子為Pol III啟動子或Pol II啟動子，優選Pol III啟動子，更優選U6啟動子，最優選人U6啟動子。

14.根據權利要求12所述的雙gRNA表達盒，其中所述tRNA選自人tRNA(Gln)(SEQ IDNo：14)或水稻tRNA(Gly)(SEQ ID No：15)。