[發明專利]一種嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒的測試方法

在審

• 申請號: 202010437277.6
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111549091A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 季江;焦晴晴;趙瑩;魏鈺倩;蘇文星
• 申請（專利權）人: 核工業總醫院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 蘇州國誠專利代理有限公司 32293
• 代理人: 韓鳳

本發明一種嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒的測試方法，包括：稀釋待測過敏原制成標準待測過敏原，設立陽性對照和陰性對照；所有待測樣本為肝素化的患者外周血，需封口孵育；隨后加入緩沖液，離心；加入熒光染色混合液，輕混至沉淀物再懸浮，避光孵育；加入紅細胞裂解液，漩渦混勻，避光孵育；稀釋，離心，再懸沉淀物；過濾后添加緩沖液，采用流式細胞儀檢測，得到活化、脫顆粒比例。本發明提供的嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒的測試方法，無需分離純化嗜堿性粒細胞，選用新的特異性嗜堿性粒細胞標記物組合，所測樣本用量小，重復性好，誤差小，有效分辨嗜堿性粒細胞的活化、脫顆粒程度，更好地為相關疾病臨床鑒別診斷和科研項目提供檢測和技術支持。

技術領域

本發明屬于過敏性疾病診斷的技術領域，具體涉及一種嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒的測試方法。

背景技術

隨著全球日趨嚴重的環境污染、化學品濫用、電離輻射、轉基因食品、以及各式各樣的食品添加劑等以一系列問題的不斷出現，“過敏”成為了人類健康的又一大“殺手”。據報告，全世界有30％-40％的人被過敏問題困擾，涉及多個器官和系統，例如皮膚過敏反應、呼吸道過敏反應、胃腸道過敏反應及過敏性休克等。2018年流行病學數據顯示，全世界3億人患有哮喘，4億人有濕疹及特異性皮炎，超過5億人患有變應性鼻炎。過敏性疾病的自然進程是過敏原的種類日益增多，例如新合成的食品添加劑、工業原料、化學試劑，甚至部分新型藥物等；臨床癥狀多變。過敏是一種復雜的免疫系統疾病，臨床表現多樣化，如過敏性鼻炎、哮喘、蕁麻疹、過敏性皮炎和濕疹等，嚴重時導致過敏性休克、喉頭水腫，哮喘突發或持續狀態，有生命危險。過敏離我們并不遙遠，輕者影響生活質量，嚴重者亦可有生命威脅，例如一代歌后鄧麗君就是哮喘突發去世的，32歲的好萊塢女星Brittany Murphy則是因藥物過敏搶救無效意外身亡。作為過敏性疾病的主要效應細胞，嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒釋放組胺是其發揮生物學功能啟動過敏進程的關鍵步驟。鑒于嗜堿性粒細胞在人外周血中較易獲得的特性，因此，嗜堿性細胞激活實驗(Basophil activation test，BAT)是迄今為止目前國際上相關實驗室正在使用的相對有效的體外過敏原檢測手段。遺憾的是，實踐結果顯示目前常用的生物標記物組合使得BAT檢測在不同個體之間的準確度、靈敏性和特異性差異較大，再加上有些過敏患者本身外周血嗜堿性粒細胞水平就較低，因此，導致目前BAT還沒有被納入常規的臨床檢測手段，只是應用于部分臨床研究。因此，尋找新的、更特異的嗜堿性粒細胞激活表面標記物以改進這一基于外周血嗜堿性粒細胞組胺釋放的過敏原檢測方法，有望可以有效的克服上述缺陷，達到高效、準確的檢測到過敏原的目的。

發明內容

為解決現有臨床和科研應用中存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒的測試方法。

為實現上述目的，達到上述技術效果，本發明采用以下技術方案來實現：

一種嗜堿性粒細胞活化、脫顆粒的測試方法，包括以下步驟：

步驟(一)、樣品和相關試劑準備

S1、對待測過敏原進行等比例稀釋，按順序編號后作為標準待測過敏原；

S2、制備陽性對照和陰性對照；

S3、用無菌雙蒸水按1:10-12的比例稀釋紅細胞裂解液，備用；

步驟(二)、樣品孵育和檢測

S4、將步驟S1-S2制備的陽性對照、陰性對照和標準待測試過敏原樣品分別轉移至流式細胞上樣管中，每管中分別添加100-120μL待測肝素化患者血液，封口孵育；

S5、向上述步驟中得到的所有樣本中加入2-4mL PBS/EDTA，于4℃、340g離心力條件下離心10-15min，吸出上清液；

S6、向所有樣本中分別加入50-60μL熒光染色混合液，輕混至沉淀物再懸浮，室溫避光孵育；