[發(fā)明專利]一種蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的生物合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010436910.X
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111560391B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 張文彬;劉雅杰
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K14/47;C07K19/00;C07K1/22;C12N15/70
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產(chǎn)權代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

1.一種蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的生物合成方法，包括以下步驟：

1) 設計蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的蛋白質(zhì)前體序列，其基本結構由N端到C端包括：L_1-1-X-L_1-2-原位酶切位點-L_2-1-X-L_2-2，其中，X代表形成二聚體的纏結基元，該纏結基元為同質(zhì)或為異質(zhì)，即兩個X相同或不同；L_1-1/L_1-2、L_2-1/L_2-2代表在胞內(nèi)發(fā)生正交偶聯(lián)反應的兩對環(huán)化基元，這兩對環(huán)化基元為兩種正交的多肽-蛋白質(zhì)反應對，或者多肽-蛋白質(zhì)反應對和斷裂內(nèi)含肽組合，或者兩種正交的斷裂內(nèi)含肽；當L_1-1/L_1-2為多肽-蛋白質(zhì)反應對時，在L_1-2與L_2-1之間插入的原位酶切位點為必要元件，通過在胞內(nèi)共表達蛋白酶對該位點進行原位酶切，否則所述原位酶切位點為非必要元件；在上述基本結構中插入目標蛋白序列，插入位點選自：X結構域前和/或X結構域后、多肽-蛋白質(zhì)反應對的N端和/或C端；

2) 構建步驟1）所述蛋白質(zhì)前體序列對應的編碼基因序列，并引入表達載體中；

3) 將步驟2）構建的表達載體轉入細胞中進行表達，當原位酶切位點為必要元件時在細胞內(nèi)共表達切割所述原位酶切位點的蛋白酶；

4) 對步驟3）獲得的融合蛋白進行純化，得到相應的蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中所述纏結基元為p53dim結構域，其中p53dim結構域的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中所述多肽-蛋白質(zhì)反應對選自諜標簽-諜捕手反應對、探標簽-探捕手反應對。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述諜標簽-諜捕手反應對中諜標簽和諜捕手的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中所述斷裂內(nèi)含肽為NpuDnaE斷裂內(nèi)含肽，由IntC1和IntN1組成環(huán)化基元，或者由IntC2和IntN2組成環(huán)化基元，IntC1、IntN1、IntC2和IntN2的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）中設計的原位酶切位點是TVMV蛋白酶的識別序列ETVRFQG，或者是TEV蛋白酶的識別序列ENLYFQG；相應的在步驟3）中共表達TVMV蛋白酶或TEV蛋白酶。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）在第二個纏結基元X之前引入了組氨酸標簽序列，在步驟4)通過鎳柱親和層析進行蛋白純化。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）設計的蛋白質(zhì)前體序列基本結構為SpyCatcher-p53dim-SpyTag-IntC1-p53dim-IntN1，從N端到C端依次是環(huán)化反應基元諜捕手SpyCatcher、纏結基元p53dim結構域、環(huán)化反應基元諜標簽SpyTag、斷裂內(nèi)含肽C端部分IntC1、纏結基元p53dim結構域和斷裂內(nèi)含肽N端部分IntN1；在SpyTag和IntC1之間插入TVMV蛋白酶的識別序列，并在第二個p53dim結構域之前引入了組氨酸標簽序列；一個或多個相同或不同的目標蛋白的融合位點選自：p53dim結構域前和/或p53dim結構域后、SpyCatcher的N端、SpyTag的C端。