[發(fā)明專利]一株無痕刪除桔青霉素合成基因的紅曲霉工業(yè)菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010432455.6
• 申請(qǐng)日: 2020-05-20
• 公開（公告）號(hào): CN111549075B
• 公開（公告）日: 2023-02-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李綺雯;容艷筠;肖偉俊;高書山;高健信;李英明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東科隆生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P1/02
• 分類號(hào): C12P1/02;C12N1/15;C12N15/80;C12N15/90;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京商專永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 方挺;黃謙

1.一種基因工程改造的紅曲霉的制備方法，其特征在于以野生型紅曲霉為原料，具體包括以下步驟：

提取野生型紅曲霉基因組DNA；

根據(jù)野生型紅曲霉桔青霉素生物合成基因簇上下游序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增up和down片段的引物：以紅曲霉的基因組DNA為模板，cit-up-F/R和cit-dn-F/R分別做為引物擴(kuò)增得到pKL-03質(zhì)粒上的up和down片段；Pgpda-F/sgRNA-R和sgRNA-F/TtrpC-R以pFC333質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到組裝pKL-05質(zhì)粒所需的片段sgRNA-1和sgRNA-2；

提取pFC-333和pUC-57載體；

pFC333載體使用BglII和PacI兩種內(nèi)切酶酶切；

pUC57載體使用EcoRI和HindIII雙酶切；

回收酶切后的載體和目的片段；

酶切后的pFC-333和pUC-57載體與目的片段連接：pUC57載體和up以及down片段通過吉布森組裝得到pKL-03質(zhì)粒，酶切后的pFC333載體和sgRNA-1以及sgRNA-2通過吉布森組裝得到pKL-05質(zhì)粒；

制備野生型紅曲霉原生質(zhì)體；

將pKL-03和pKL-05質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體；

制備得到基因工程改造的紅曲霉；

引物序列如下：

所述的一種基因工程改造的紅曲霉，其刪除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整個(gè)生物合成基因簇；所刪除的桔青霉素生物合成基因簇序列如SEQ ID NO.1所示；基因工程改造的紅曲霉包含如SEQ ID NO.2所示的基因序列。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：吉布森組裝體系如下：Gisbon溶液15uL，載體加片段共5uL，其中載體與片段摩爾比為1:1。

3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：野生型紅曲霉原生質(zhì)體的制作方法如下：

a. 將野生型紅曲霉接種平板上，培養(yǎng)；

b. 接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；

c. 離心收集菌絲；

d. 加入酶解液搖床中培養(yǎng)；

e. 輕輕滴加等體積trapping buffer，離心，收集中間層的原生質(zhì)體；

f. 加入STC buffer，離心，去除液體；

g. 加入STC buffer重懸。

4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述將pKL-03和pKL-05質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，步驟如下：

a. 取pKL-03和pKL-05質(zhì)粒，加入到原生質(zhì)體中；

b. 加入60% PEG Solution，混勻；

c. 與不含抗性的PDA-Sorbitol培養(yǎng)基混合后，培養(yǎng)，在表面再倒一層含有100μg/mL潮霉素的PDA-Sorbitol培養(yǎng)基。