[發明專利]一種重組酶聚合酶擴增光電化學循環腫瘤DNA液體活檢的方法

在審

• 申請號: 202010429706.5
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111534595A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 混旭;鄧陸平;孟玉嬋;王浩
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6844;C01B19/04;B82Y30/00;B82Y40/00
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 雷斐

1.一種重組酶聚合酶擴增光電化學循環腫瘤DNA液體活檢的方法，其特征在于，首先，將AuNPs@ZnSeNSs修飾到GE上，然后通過Au-S鍵將FP固定在AuNPs@ZnSeNSs/GE上；加入含有KLK2的樣品后，電極表面的FP和溶液中的RP在重組酶聚合酶的存在下進行RPA擴增；在電極上擴增了靶標，并在電極表面捕獲了RP；洗滌后，St-ALP通過生物素和鏈霉親和素之間的親和作用連接在電極上；ALP催化水解p-NPP為p-NP；由于ALP的高催化活性，產生了許多p-NP；在MB和p-NP的作用下產生強的光電信號，根據PEC信號強度實現KLK2含量的測定；由于MB和p-NP共調控作用、MB的循環，以及重組酶聚合酶擴增實現了目標物的高靈敏度檢測；在MB和p-NP存在的情況下，AuNPs@ZnSeNSs/GE在0V時產生強的光電流，具有自供能特性，結合原位重組酶聚合酶擴增策略，建立了一種前列腺癌循環腫瘤DNA KLK2液體活檢新方法；具體步驟為：

ZnSe納米片的制備包括以下步驟：

通過超聲剝離方法剝離得到ZnSe納米片；首先，將0.1mg～450mg的ZnSe加到1mL～150mL DMF溶液中，然后將混合物通過超聲分散0.1h～100h，以獲得黃色分散液；接下來，在14,000rpm條件下離心20min，從分散液中分離出剝離的ZnSe，并用乙醇洗滌3次；最后，將ZnSeNSs懸浮液用于下一實驗；

AuNPs@ZnSeNSs的合成包括以下步驟：

通過原位生長法制備AuNPs@ZnSeNSs；將0.1mL～30mL ZnSeNSs和0.1mL～10mLHAuCl₄·4H₂O加入到燒瓶中，在攪拌下通過油浴加熱至115℃；溶液繼續回流并攪拌3分鐘；然后，將0.1mL～10mL 1.66mg/mL的檸檬酸鈉溶液滴入燒瓶中；將該混合物在115℃下回流3分鐘，得到黑色的AuNPs@ZnSeNSs；在14,000rpm條件下離心10min，收集最終的黑色沉淀物；在AuNPs@ZnSeNSs的合成方法中，不同質量的氯金酸會影響PEC信號；ZnSeNSs與氯金酸的質量比分別為1:0.2、1:0.33、1:0.66、1:1、1:1.5；

KLK2檢測包括以下步驟：

將1μL～60μL AuNPs@ZnSeNSs滴到金電極表面，并在空氣中自然干燥；然后將1μL～60μL的10mM TCEP加到1μL～60μL的10μM FP溶液中，將混合物溶液在37℃下孵育；60分鐘后，將1μL～60μL混合物添加到AuNPs@ZnSeNSs/GE的表面，并在37℃條件下孵育2小時，得到FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE；然后，將FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE浸入1mM MCH溶液中1h以消除非特異性吸附；接下來，制備RPA溶液用于KLK2基因的表面擴增；RPA反應溶液由2.4μL 10μM RP，13.2μL不含DNase的水，31.9μL重組酶聚合酶緩沖溶液和2.5μL280mM醋酸鎂溶液制成；然后將1μL～50μL該RPA溶液和1μL～50μL含KLK2的樣品添加到FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE的表面上；在37℃擴增30分鐘后，電極用0.1M PBS洗滌；最后，將電極浸入2μL～60μL 1μM St-ALP溶液中，在37℃下孵育30分鐘，用0.1M PBS洗滌電極，將電極插入p-NPP和MB的溶液中，ALP催化水解p-NPP為p-NP；在MB和p-NP的作用下產生強的光電信號，根據PEC信號強度實現KLK2含量的測定。

正向引物、反向引物和KLK2基因的序列如下：

KLK2正向引物(FP)：5'-SH-GGGGGTCCACTTGTCTGTAA-3'

KLK2反向引物(RP)5'-GGTGAGTTCCAAGCTTCAGG-biotin-3'

KLK2基因：5'-GGGGGTCCA CTTGTCTGTA ATGGTGTGCT TCAAGGTATC ACATCATGGGGCCCTGAGCC ATGTGCCCTG CCTGAAAAGC CTGCTGTGTA CACCAAGGTG GTGCATTACC GGAAGTGGATCAAGGACACC ATCGCAGCCA ACCCCTGAGT GCCCCTGTCC CACCCCTACC TCTAGTAAAT TTAAGTCCACCTCACGTTCT GGCATCACTT GGCCTTTCTG GATGCTGGAC ACCTGAAGCT TGGAACTCAC C-3' 。

2.根據權利要求1所述的一種重組酶聚合酶擴增光電化學循環腫瘤DNA液體活檢的方法，其所用的試劑和儀器如下：

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、巰基乙胺(MCH)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶(St-ALP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由Sangon Biotech Co.，Ltd.(中國，上海)提供；TwistAmp Basic RT-RPA試劑盒(Twist-DX)、重組酶聚合酶緩沖溶液從Babraham(UK)購買的；生物素標記的反向引物(RP)、巰基化正向引物(FP)由Sangon Biotech Co.，Ltd.(中國，上海)合成，

聚丙烯酰胺凝膠電泳分析是使用ADYCP-31E電泳儀，購于WoDeLife SciencesInstrument Co.，Ltd.；所有光致電化學測量均在CHI660E電化學工作站上進行，購于上海辰華儀器有限公司。