[發(fā)明專利]一種用于甲狀腺癌檢測的試劑盒及其使用方法、應用

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• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111549136A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 王志強;萬季;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;夏迪;汪健;金泰慶;關建洪;王弈;宋麒
• 申請（專利權）人: 深圳市新合生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠和權律師事務所 11399
• 代理人: 安琪

本發(fā)明公開了一種用于甲狀腺癌檢測或者篩查的試劑盒及其使用方法、應用。該試劑盒包括檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態(tài)或水平的特異性引物和探針，所述特定基因為NR2F1和ACTB。本發(fā)明試劑盒能夠顯著提高早期甲狀腺癌的陽性檢出率和特異性(真實陰性率)，可將生物標記物的檢測靈敏度提高到皮克/納克級DNA分子，檢測靈敏度的提高是通過優(yōu)化特定核苷酸序列引物及DNA探針以及改進血漿游離DNA的亞硫酸氫鹽處理方法來實現的。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術和DNA檢測技術領域，尤其涉及一種用于甲狀腺癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒及其使用方法、應用，具體而言，涉及一種利用血漿游離DNA進行甲基化qPCR以確定一個目標基因靶點(例如NR2F1和NR2F1)的甲基化狀態(tài)來用于甲狀腺癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法，此外，本發(fā)明還涉及上述檢測試劑盒在生物醫(yī)學中的應用。

背景技術

甲狀腺癌發(fā)病率占內分泌腫瘤的首位，也是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。2018年全國最新癌癥報告指出甲狀腺癌主要出現在女性人群中，發(fā)達國家女性甲狀腺癌發(fā)病排名第7位，發(fā)展中國家女性甲狀腺癌發(fā)病排名第9位。我國東部地區(qū)甲狀腺癌發(fā)病率遠高于中、西部地區(qū)，女性發(fā)病率遠高于男性。甲狀腺癌是30歲以下女性人群的最主要癌癥類型。近年來，我國甲狀腺癌發(fā)病率明顯上升，但死亡率則相對穩(wěn)定在較低水平，其他國家也發(fā)現了類似趨勢，這可能與甲狀腺癌的過度診斷有關。我國甲狀腺癌發(fā)病率存在地區(qū)差異，這可能是由于不同地區(qū)甲狀腺癌篩查率不同所導致的。

甲狀腺結節(jié)是指甲狀腺細胞在局部異常生長所引起的散在病變。頸部超聲檢查是對甲狀腺結節(jié)進行初始癌癥風險分層的主要檢查方法，隨后決定是否對可疑結節(jié)進行細針穿刺活檢(fine needle aspiration biopsy，FNAB)。然而，在某些情況下，由于惡性和良性甲狀腺結節(jié)之間的細胞學特征重疊，約20％至40％的術前活檢組織難以將良性甲狀腺結節(jié)與甲狀腺癌區(qū)分開來。此外，實驗室血清學檢查(促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺球蛋白(Tg)及降鈣素(Ct))也是目前臨床上鑒別良惡性結節(jié)的常用方法，但由于其在甲狀腺非腫瘤疾病中也存在較高的含量，從而特異性較低。報道指出TC診斷的不確定性僅在美國每年就導致多達50,000名患者接受不必要的甲狀腺切除術。因此，傳統(tǒng)的TC患者診斷方法的補充和完善仍然是亟待解決的問題。

DNA甲基化改變是癌癥進程中最早發(fā)生的分子變化之一，且具有組織特異性，腫瘤抑制基因的高甲基化水平已被確定為抑制基因表達和促進癌細胞生長和擴增的重要機制。腫瘤患者外周血中可檢測到腫瘤細胞壞死、凋亡所釋放的ctDNA(circulating tumorDNA)，由于其攜帶有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學改變，理論上可以利用ctDNA甲基化對腫瘤進行診斷。研究表明，多個抑癌基因如CDKN2A、RASSF1、ECAD、NIS-L、ATM等在甲狀腺癌中都有相當高的比例因發(fā)生甲基化而失活。

發(fā)明內容

在上述資料的基礎上，我們通過更加廣泛和深入的研究，發(fā)現了可用于早期甲狀腺癌篩查的更好的甲基化基因靶點，并設計出數套可針對這些靶點進行甲基化檢測的引物及探針組合，利用新發(fā)現的基因靶標檢測組合制成了早期甲狀腺癌的檢測和篩查以及甲狀腺良性和惡性結節(jié)鑒別的試劑盒。

本發(fā)明的目的在于提供一種用于甲狀腺癌早期診斷、檢測或者篩查的血液單基因檢測引物探針組合試劑盒，以解決現有技術中存在的檢測方法特異性和敏感性過低的缺陷。

本發(fā)明的第一方面在于提供一種用于甲狀腺癌檢測的試劑盒，包括檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態(tài)或水平的特異性引物和探針，所述特定基因為NR2F 1和ACTB。