[發(fā)明專利]宏基因組文庫及建庫方法和應用

在審

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• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111575348A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發(fā)明（設計）人: 許騰;曾偉奇;謝淑媚;秦璐;唐毅;李永軍;王小銳;蘇杭
• 申請（專利權）人: 廣州微遠基因科技有限公司;廣州微遠醫(yī)療器械有限公司;廣州微遠醫(yī)學檢驗實驗室有限公司;深圳微遠醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

1.一種宏基因組文庫的建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：提取待測樣本中的基因組核酸；

S2：在片段化緩沖液體系中按照活性單位比為1:6-8的量加入基因組核酸和轉座酶復合體，進行片段化和加接頭反應；所述片段化緩沖液中包括數均分子量≥20,000的擁擠分子；

S3：在S2步驟得到的溶液中直接加入引物和擴增試劑，對文庫進行擴增；

S4：對擴增后的文庫進行純化，即得。

2.根據權利要求1所述的宏基因組文庫的建庫方法，其特征在于，所述S1步驟中，所述基因組核酸純度以吸光度比值計，達到OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8-2.0。

3.根據權利要求2所述的宏基因組文庫的建庫方法，其特征在于，所述S1步驟中，采用下述方法提取待測樣本中的基因組核酸：

樣本裂解：將待測樣本加入裂解液中，混合均勻，離心后65℃-70℃孵育10-15min，再次離心后冷卻至室溫；

DNA純化：將裂解后的裂解液全部轉移到吸附柱中，離心棄去廢液，加入緩沖液，離心去除結合在核酸上的蛋白質，加入緩沖液離心去除吸附在吸附柱上的離子，該步驟重復1-3次；

DNA干燥：將吸附柱置于離心管中，10000-13000r/min離心3-5min，空甩，再將吸附柱晾干3min-5min；

DNA溶解：在吸附柱中加入40-70μL TB緩沖液，放置3-6min，10000-13000r/min離心1-3min，收集DNA液體，即得。

4.根據權利要求1所述的宏基因組文庫的建庫方法，其特征在于，所述S2步驟中，在55±1℃的條件下孵育10±2min進行片段化和加接頭；所述擁擠分子選自：體積百分濃度為4-8％的PEG35,000和/或PVP K25。

5.根據權利要求1所述的宏基因組文庫的建庫方法，其特征在于，所述S3步驟中，所述擴增中溫度條件為：72℃保持3min，98℃保持30sec，按照預定循環(huán)溫度進行17±2個循環(huán)，72℃保持5min，所述循環(huán)溫度為98℃保持15sec，60℃保持30sec，72℃保持30sec；所述引物工作濃度為10±1pM；

所述S4步驟中，首先以0.8×PEG緩沖液磁珠進行純化，去除長片段，再以0.3×PEG緩沖液磁珠進行純化，去除殘留接頭。

6.根據權利要求1所述的宏基因組文庫的建庫方法，其特征在于，所述待測樣本為腦脊液、血液、肺泡灌洗液、胸腹水或尿液。

7.權利要求1-6任一項所述的宏基因組文庫的建庫方法得到的宏基因組文庫。

8.一種非診斷用途的病原檢測方法，其特征在于，包括權利要求1-6任一項所述的宏基因組文庫的建庫方法，還包括以下步驟：

S5：對構建得到的文庫以Illumina平臺測序；

S6：以生物信息學分析方法去除宿主序列，獲得病原基因信息。

9.一種病原檢測試劑盒，其特征在于，包括：

片段化及接頭試劑：包括組裝好接頭的轉座酶復合體、片段化緩沖液、片段化中止液，所述轉座酶復合體的工作用量為6-8倍活性單位的基因組核酸量，所述片段化緩沖液中包括數均分子量≥20,000的擁擠分子；

擴增試劑：包括PCR擴增酶、擴增緩沖液以及擴增引物；

純化試劑：包括0.8×PEG緩沖液磁珠，0.3×PEG緩沖液磁珠，體積百分濃度為80％的乙醇水溶液。

10.根據權利要求9所述的病原檢測試劑盒，其特征在于，所述片段化緩沖液中包括體積百分濃度為4-8％的PEG35,000和/或PVP K25，所述擴增引物的工作濃度為10±1pM。