[發明專利]一種基于深度測序的適用于HIV-1蛋白酶劣勢耐藥毒株檢測方法

有效

• 申請號: 202010424444.3
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111560474B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 李林;李韓平;李敬云;劉永健;王曉林;李天一;韓靖婉;賈磊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6848;C12Q1/6869;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

本發明公開了一種基于深度測序的適用于HIV?1蛋白酶劣勢耐藥毒株檢測方法。本發明提供了用于HIV PR耐藥檢測的引物組，由SEQ ID No.1?6所示六條引物，以及分別在SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的5’末端連接Barcode序列后所示兩條引物組成。本發明中PR的cDNA合成和巢式PCR第一輪擴增在同一反應體系中完成；巢式PCR第二輪擴增中在引物的首尾加上Barcode序列；第二輪擴增產物純化后進行高通量測序，從而獲得HIV?1PR劣勢耐藥毒株信息。本發明建立的新型HIV?1蛋白酶劣勢耐藥毒株耐藥檢測方法，低成本、產出高。本發明對于艾滋病防治和公共衛生具有重大影響。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種基于深度測序的適用于HIV-1蛋白酶劣勢耐藥毒株檢測方法。

背景技術

自1981年HIV被發現，其在全球迅速蔓延，先后導致近3,700萬人感染，在全球引發了嚴重的公共衛生問題。為了響應WHO提出的3個90％的防治目標，抗病毒治療(ART)作為一種防控手段在全球廣泛推廣應用，該手段有效地延緩了HIV感染者的疾病進程，控制了艾滋病的快速蔓延。截止到目前，全球已經有超過2,100萬HIV感染者接受了ART，對于感染者體內病毒抑制和免疫重建起到了積極作用。中國近年來快速擴大治療，目前已有超過50萬HIV感染者接受了免費ART，為改善艾滋病患者生命質量、延長生命周期、減少艾滋病的傳播都貢獻了力量。

隨著ART的廣泛應用，HIV耐藥性問題逐步凸顯，已經成為艾滋病防控和治療領域的關鍵問題。HIV耐藥性是病毒、藥物和宿主共同作用的結果。在藥物選擇壓力下，HIV耐藥毒株被篩選出來并逐漸發展成為優勢毒株，臨床表現為藥物敏感性降低和/或病毒學反應不理想，最終影響ART的治療效果。耐藥導致ART失敗的報道層出不窮，如在某些開展ART地區進行的耐藥監測顯示，約有50％患者經歷免疫學失敗，繼而HIV耐藥性毒株出現并快速流行；某些地區，針對一線藥物的耐藥性毒株的流行率已超過50％，并且新診斷人群傳播性耐藥亦呈快速上升趨勢。HIV耐藥毒株的傳播與流行為艾滋病的防控也帶來了前所未有的困難。

越來越多的證據表明，HIV-1感染者體內存在的劣勢耐藥毒株對抗病毒治療效果有顯著的影響，并且劣勢耐藥毒株常常是傳播的原發耐藥毒株的存在形式。習慣上我們將基于群體測序(population-based sequencing)未能檢測到的、攜帶有導致對藥物敏感性下降的突變位點的變異/突變毒株稱之為劣勢耐藥毒株(Minor HIV-1Drug ResistanceStrains)，這些毒株在體內龐雜的HIV-1準種家族中所占比例往往不到20％，而這些少量存在的劣勢耐藥毒株在藥物選擇壓力與趨利避害進化過程中發展成為優勢毒株，最終導致抗病毒治療的失敗。如何在抗病毒治療前了解患者本底耐藥情況、體內劣勢耐藥毒株存在情況，對指導后期的抗病毒治療具有重要的指導意義；如何為抗病毒治療失敗患者選擇切實可行的后期治療方案，劣勢耐藥毒株的檢測對方案的選擇也是大有裨益。檢測艾滋病患者體內劣勢耐藥毒株并將這一檢測結果應用于艾滋病的防控已成為全球共識。在抗病毒治療領域，發現未治療人群中存在的劣勢耐藥毒株會增加治療失敗的風險，即使劣勢耐藥毒株所占份額不足1％，它也會使得病毒學抑制失敗的風險增加2.5倍左右；越來越多的數據證明，多數抗病毒治療的失敗與基線水平存在的劣勢耐藥毒株有關。通過對傳播性耐藥(transmitted drug-resistance,TDR)的研究，多數TDR傳給未經抗病毒治療的個體時以劣勢毒株形式存在，而常規方法往往又無法檢測到這一低水平的劣勢耐藥毒株，這為TDR的防控帶來了困難。此外，HIV劣勢耐藥毒株亦是HIV-1準種家族的一份子，該毒株在患者體內如何進化也是一個備受關注的問題。