[發明專利]一種針對細胞分選后的單細胞全基因組擴增方法

在審

• 申請號: 202010423323.7
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111575346A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 陸思嘉;任軍;萬成;胡春旭;姚雅馨
• 申請（專利權）人: 泰州億康醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

本申請涉及一種針對細胞分選后的單細胞全基因組擴增方法，包括步驟：(a)對含有目標微量細胞的樣本進行細胞分選，獲得目標微量細胞；(b)將目標微量細胞采用溫和裂解體系進行裂解，獲得DNA，所述溫和裂解體系包含溫和裂解配方、較低的裂解溫度和較長的裂解時間；(c)對步驟(b)獲取的DNA采用優化的ChromInst擴增體系進行擴增獲得擴增產物，所述優化的ChromInst體系包含優化的擴增緩沖液和引物濃度、以及無dU容忍性的DNA聚合酶；能夠降低細胞分選后的細胞損傷、核酸片段化、DNA?蛋白質交聯以及堿基變異，從而提高擴增效率、擴增均勻性以及降低擴增錯誤率。

技術領域

本發明涉及一種單細胞全基因組擴增方法，具體地，本發明涉及一種針對細胞分選后的單細胞全基因組擴增方法，減少因細胞分選對單細胞全基因組擴增所造成的干擾。

背景技術

研究發現人體內有一些含量極低但具有重要研究價值的細胞，如：孕婦外周血中含有極少量的胎兒有核紅細胞，對該細胞的基因分析可用于胎兒無創產前檢測；血液中的循環腫瘤細胞，該細胞可用于腫瘤早期檢測及輔助治療；等等。由于這些細胞含量極低，因此對這些微量細胞的擴增是重要環節，目前采用的技術為單細胞全基因組擴增技術，該技術的理想是將單細胞/微量細胞中的DNA完整、準確的擴增很多倍、用于后續的基因分析。單細胞全基因組擴增技術目前主要有三種方法：1.MDA(Multiple displacementamplification,多重置換擴增)，它是2001年由Laskin團隊發明，具有很強的鏈置換性、可在等溫條件下擴增；2.MALBAC(multiple annealing and looping-based amplificationcycles，多次退火環狀循環擴增技術)，它是2012年由謝曉亮團隊發明，擬線性的擴增過程降低了指數擴增的序列偏好性，MALBAC的起始模板量可低至皮克級，并且具有很好的擴增均一性及較小的擴增偏差；3.ChromInst擴增技術，它是2016年由億康基因在MALBAC的基礎上進行優化得到的一個試劑盒產品，ChromInst為該試劑盒的商標，業界簡稱ChromInst擴增技術，ChromInst擴增的起始模板量也可低至皮克級，并且操作步驟簡化，能夠實現一步成庫，并且具有良好的擴增效果、基因組覆蓋率及較小的擴增偏差。

但是，由于對所述單細胞/微量細胞的分離、捕獲過程應用的細胞分選技術，會對后續單細胞全基因組擴增造成干擾，導致擴增效率低、偏好性顯著、擴增錯誤率高的問題，影響基因分析結果的準確性。具體的，細胞分選是將一種細胞從多種細胞中分離出來的技術，常見的是利用熒光標記的特性來分離細胞，例如熒光激活細胞分選技術(FACS，fluorescence-activated cell sorting)，細胞分選時使用的熒光標記物質、或固定劑如：碘化丙啶、多聚甲醛，會造成細胞損傷、核酸片段化、DNA-蛋白質交聯，從而導致擴增效率低(擴增產物少，總量不足1μg)、具有顯著的偏好性；另外，固定劑的使用，還會造成脫氨基作用導致的C堿基變成U堿基，從而導致擴增錯誤率高，這也是單細胞/微量細胞捕獲和擴增后，對下游應用的主要限制因素。

因此，本領域迫切需要一種針對細胞分選后的單細胞全基因組擴增方法，能夠降低細胞分選對后續單細胞全基因組擴增的影響，從而使擴增效率更高、擴增均勻性更好、擴增錯誤率低。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種針對細胞分選后的單細胞全基因組擴增方法，能夠降低細胞分選后的細胞損傷、核酸片段化、DNA-蛋白質交聯以及堿基變異，從而提高擴增效率、擴增均勻性以及降低擴增錯誤率。

本申請人經過長期廣泛深入的研究，通過大量篩選和測試，首次發現，對于孕婦外周血中的胎兒有核紅細胞、血液中的循環腫瘤細胞、卵細胞、生殖細胞、腫瘤組織細胞等人體內微量細胞，進行細胞分選后，通過優化的裂解體系和擴增體系，具體的，通過利用溫和的裂解體系及優化的擴增體系，進行裂解及單細胞全基因組擴增，可獲得更高的擴增效率、更好的擴增均勻性、且擴增錯誤率低。在一些實施方案中，可實現在單細胞水平有效擴增2-4ug的全基因組產物、覆蓋度＞90％、重復單一位點擴增成功率＞95％。