[發(fā)明專利]一種肉毒毒素蛋白晶體結(jié)構(gòu)及晶體制備方法和解析方法

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• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111675754A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 唐麟
• 申請（專利權(quán)）人: 四川一埃科技有限公司
• 主分類號: C07K14/33
• 分類號: C07K14/33;C07K1/22;C07K1/30;C12N15/70;G16B15/20
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 郭艷艷

1.一種肉毒毒素蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其特征在于，該晶體具有空間群P2₁2₁2₁，晶胞參數(shù)為

2.權(quán)利要求1所述的肉毒毒素蛋白晶體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建肉毒毒素蛋白功能結(jié)構(gòu)域

將目的基因與載體連接，得重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進行擴增，測序；

(2)肉毒毒素蛋白功能結(jié)構(gòu)域的表達

將測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，得到表達肉毒毒素蛋白功能結(jié)構(gòu)域的的菌株；

(3)純化

將表達肉毒毒素蛋白功能結(jié)構(gòu)域的的菌株接種到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，收集菌體，然后對菌體進行重懸，破碎，離心得上清液，將上清液加入親和層析柱中，并用緩沖液平衡純化柱，之后分別用buffer 1、buffer 2、elute buffer沖洗純化柱，并將每一個洗脫下來的蛋白峰分別收集，用SDS-PAGE驗證，然后對分離得到的蛋白液進行濃縮，制得肉毒毒素蛋白晶體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肉毒毒素蛋白晶體的制備方法，其特征在于，buffer 1包括25mM Tris-HCl、150mM NaCl、20mM咪唑，buffer 1的pH為8.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肉毒毒素蛋白晶體的制備方法，其特征在于，buffer 2包括25mM Tris-HCl、150mM NaCl、40mM咪唑，buffer 2的pH為8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肉毒毒素蛋白晶體的制備方法，其特征在于，elute buffer包括25mM Tris-HCl、150mM NaCl、280mM咪唑，elute buffer的pH為8.0。

6.權(quán)利要求1所述的肉毒毒素蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對純化的肉毒毒素蛋白進行處理，得到分散的肉毒毒素蛋白溶液；

(2)采用坐滴法對分散的肉毒毒素蛋白溶液進行初篩，然后用懸滴法進行復篩，獲得肉毒毒素蛋白晶體；

(3)將肉毒毒素蛋白晶體用液氮進行處理，利用X射線源獲得晶體數(shù)據(jù)；

(4)將獲得的晶體數(shù)據(jù)用iMosflm處理，并利用CCP4中MOLREP程序通過分子置換法進行結(jié)構(gòu)解析，利用CCOT進行模型搭建，利用CNS或phenix進行結(jié)構(gòu)修正。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肉毒毒素蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析方法，其特征在于，步驟(1)中將純化后的肉毒毒素蛋白與緩沖液、Tris-HCl和NaCl溶液混合，得到分散的肉毒毒素蛋白溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肉毒毒素蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析方法，其特征在于，初篩具體過程為：向座滴板的每孔中加入池液500ul，在晶體孔中加入含1μL蛋白質(zhì)復合物和1μL池液的生長液滴，溫度為20℃，培養(yǎng)1周。