[發明專利]一種基于金屬離子依賴性DNA酶用于檢測鄰苯二甲酸二丁酯的電化學免疫傳感器制備方法

有效

• 申請號: 202010420081.6
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111398392B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 何保山;李嘉雯;衛敏;吳立根;趙文紅;金華麗;任文潔;王濤;姜利英;魏濤
• 申請（專利權）人: 河南工業大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于金屬離子依賴性DNA酶用于檢測鄰苯二甲酸二丁酯的電化學免疫傳感器制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）功能化二維碳基材料/金屬有機框架/多刺金納米顆粒復合材料的制備：采用水熱合成法處理二維碳基材料，稱取10~20 mg二維碳基材料加入25~50 mL 0.01~0.02 M pH值為7.0~9.0緩沖液中，超聲處理1~3 h，隨后，稱取5~10 mg羥氨基官能化材料單體添加到二維碳基材料分散液中，用高純中性氣體將溶液脫氣10~20 min，在冰浴條件下將上述溶液超聲處理10~20 min，然后在50~70℃下反應24~30 h以獲得羥氨基功能化二維碳基材料的黑色懸浮液，最后，在8000~10000 rpm轉速下離心3~5次收集產品，在60~70℃下干燥至恒重；采用溶劑熱法合成氨基化金屬有機框架，稱取0.1~0.3 g聚乙烯吡咯烷酮溶于4.5~13.5 mL分散劑中，再稱取100~150 mg六水合硝酸類金屬化合物，30~50 mg 2-氨基對苯二甲酸和40~100 μL三乙胺的混合物添加到上述溶液中，并超聲處理20~30 min，之后，將均相溶液置入高壓釜中于105~125℃反應18~24 h，冷卻至20~25℃后，在8000~10000 rpm轉速下離心并用分散劑、乙醇洗滌3~5次收集產物，最后在60~70℃干燥至恒重；采用種子介導生長法和檸檬酸鹽還原法制備多刺金納米顆粒，量取2~4 mL 0.01~0.03 M氯金酸溶液，加入6~8 mL 質量百分比為5~8%的檸檬酸鈉溶液，量取500~800 μL上述溶液添加到2~4 mL水溶液中，并用6~8mL 質量百分比為5~8％的檸檬酸鈉溶液調節pH 值為6.0~8.0，在輕微搖動下，將0.3~0.5mL 0.01~0.03 M氯金酸溶液添加到上述混合物中，溶液的顏色從淺粉紅色變淺紫色，在5000~8000 rpm轉速下離心7~10 min收集得到的多刺金納米顆粒，用水洗滌3~5次后分散到水中；采用物理吸附法制備復合材料，稱取上述4~8 mg功能化二維碳基材料溶解于2~4 mL的蒸餾水中，加入500~1000 μL上述多刺金納米顆粒溶液和500~1000 μL 2~5 mg·mL^-1上述金屬有機框架溶液，將上述混合液置于搖床上震蕩12~14 h，干燥即得到功能化二維碳基材料/金屬有機框架/多刺金納米顆粒復合材料；

（2）信號分子/金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球/DNA-1信號標簽的制備：采用一步溶劑熱法合成介孔金屬氧化物納米球，稱取2~4 g無水金屬氯化物添加到40~80 mL乙二醇中并溶解，稱取6~10 g無水乙酸鈉和20~35 mL氨基官能化溶液加入上述溶液中并劇烈攪拌30~60 min，將混合溶液倒入反應釜加熱至180~250°C持續8~12 h，冷卻至20~25℃后，將沉淀物用大量超純水洗滌至中性，最后將產品在50~70℃下干燥；采用化學鍵合法合成金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球，稱取5~10 mg介孔金屬氧化物納米球分散在5~10 mL蒸餾水中，在劇烈攪拌下將10~15 mL 15 mM氯金酸溶液和2~5 mL 質量百分比1~3％的還原劑加入上述溶液中，在8000~12000 rpm轉速下離心5~10 min收集產物并用乙醇洗滌3~5次；采用化學鍵合法合成信號分子/金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球/DNA-1信號標簽，量取1~3 mL0.3~1 mM信號分子溶液加入到3~6 mL金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球溶液中，并在4~8°C下柔和攪拌12~16 h，在8000~12000 rpm轉速下離心5~10 min收集產物，在60~70°C下干燥16~20 h，將收集的信號分子/金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球添加到2~6 μM 0.5~1mL巰基修飾的金屬離子依賴性DNA酶底物鏈DNA-1中，在搖床上振蕩反應8~16 h，最后，加入100~200 μL 質量百分比0.1~0.25％牛血清白蛋白溶液振蕩反應1~2 h，得到了信號分子/金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球/DNA-1信號標簽；

（3）功能化二維碳基材料/金屬有機框架/多刺金納米顆粒復合材料/金屬離子依賴性DNA酶/金電極的制備：用0.02~0.05 μm Al₂O₃粉末將直徑為1~4 mm金電極拋光，然后依次在乙醇和雙蒸餾水中超聲處理，將其置于強氧化溶液中20~60 min，用蒸餾水沖洗干燥后，將2~5 μL功能化二維碳基材料/金屬有機框架/多刺金納米顆粒復合材料懸浮液滴加到金電極表面上，并在20~24°C下干燥，依次將3~5 μL 0.05~1 μg·mL^-1鄰苯二甲酸二丁酯抗體溶液和5~10 μL信號分子/金納米粒子/介孔金屬氧化物納米球/DNA-1滴加到電極上，在35~38°C下孵育1~2.5 h，移取3~10 μL 0.1~0.5 mM的封閉劑滴加在電極上，在35~38°C下孵育30~50min，在體外先將200~1000 μL 5~10 μg·mL^-1 DBP-BSA偶聯物加入至200~1000 μL 2~6 μM氨基修飾的金屬離子依賴性DNA酶DNA-2中，再加入50~100 μL 0.1~0.25%的戊二醛，在35~38°C下反應8~10 h，得到了DBP-BSA-DNA-2溶液，加入3~5 μL鄰苯二甲酸二丁酯標準溶液和3~5 μL DBP-BSA-DNA-2的混合物，在35~38°C孵育30~60 min，加入3~10 μL 5~10 μg·mL^-1的金屬離子溶液在35~38°C下反應30~60 min，得到功能化二維碳基材料/金屬有機框架/多刺金納米顆粒復合材料/金屬離子依賴性DNA酶/金電極；

（4）電化學傳感器是以功能化二維碳基材料/金屬有機框架/多刺金納米顆粒復合材料/金屬離子依賴性DNA酶/金電極為工作電極，以鉑絲電極為對電極，飽和氯化銀為參比電極，通過信號分子響應信號的變化獲得樣本中鄰苯二甲酸二丁酯的含量，從而得到了用于鄰苯二甲酸二丁酯檢測的電化學傳感器。