[發明專利]梨頭霉甾體11β-羥化酶CYP5311B2突變體構建及其應用

在審

• 申請號: 202010416653.3
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN113684191A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 劉曉光;張會霞;路福平
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12P33/00;C12R1/865
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本發明涉及利用定向進化和定點飽和突變以及利用釀酒酵母表達平臺篩選高甾體羥化特異性的C11β?羥化酶CYP5311B2突變體，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3所示；羥化酶突變體氨基酸序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4所示。本發明還涉及CYP5311B2突變體異源表達的重組載體，過表達重組基因工程菌以及基于表達突變體的重組工程菌的高效甾體C11β?羥化工藝。

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及C11β-羥化酶突變體及其應用。

背景技術

甾體激素藥物氫化可的松是一種具有顯著抗炎、抗毒、抗休克等療效的重要糖皮質激素藥物，同時也是合成系列高效糖皮質激素藥物的關鍵中間體。在甾體激素藥物的生產中，微生物轉化技術已成為許多甾體化合物或其中間體合成路線的關鍵技術。

目前基于絲狀真菌藍色梨頭霉生物直接羥化底物11-脫氧可的松合成氫化可的松的生產工藝具有投料濃低(2-3g/L)，副產物高(25-30％)等缺點，嚴重制約了氫化可的松生產效率。另一方面藍色梨頭霉遺傳背景不清晰，進行菌種改造比較困難。

參與微生物甾體化合物羥化反應的羥基化酶屬于P450酶系，我們克隆鑒定了藍色梨頭霉中編碼甾體C11β-羥化酶的基因CYP5311B2(簡稱為CYP-7)并構建了重組表達載體和重組酵母菌。

同絲狀真菌藍色梨頭霉一樣，表達絲狀真菌藍色梨頭霉甾體C11β-羥化酶的基因CYP-7重組酵母菌轉化底物11-脫氧可的松形成多種副產物，為了改進C11β-羥化反應特異性，本發明提供的表達CYP-7突變體Z4(321Q、322 I、323 I、326 A/327 L)和Z8(V309I)的重組釀酒酵母工程菌轉化底物11-脫氧可的松都顯示明顯改善的C11β-羥化特異性。基于以上突變體重組酵母的11-脫氧可的松轉化工藝形成顯著減少的副產物。

發明內容：

本發明涉及利用定向進化和定點飽和突變以及利用釀酒酵母表達平臺篩選高甾體羥化特異性的C11β-羥化酶CYP-7突變體Z4和Z8，本發明還涉及CYP-7突變體異源表達的重組載體，過表達重組基因工程菌以及基于表達突變體的重組工程菌的高效甾體C11β-羥化工藝。

本發明所述含有基因CYP-7的表達盒、表達載體、重組表達質粒或宿主細胞也屬于本發明的保護范圍。

含有本發明所述11β-羥化酶基因CYP-7 DNA全長或部分片段的定點突變和飽和突變引物序列也屬于本發明的保護范圍。

本發明所述C11β-羥化酶CYP-7突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示，其相應的DNA序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示屬于本發明的保護范圍。

本發明所述C11β-羥化酶CYP-7突變體，可以用于工業轉化脫氧可的松生產氫化可的松。

本發明所述C11β-羥化酶CYP-7突變體，轉化甾體脫氧可的松合成氫化可的松時副產物明顯減少。

本發明所述C11β-羥化酶基因CYP-7定點突變和飽和突變所涉及的特定位置氨基酸也屬于本發明的保護范圍。

本發明所述C11β-羥化酶CYP-7突變體重組表達載體或重組釀酒酵母宿主菌表達C11β-羥化酶CYP-7突變體的應用也屬于本發明的保護范圍。

本發明所述一種高效制備氫化可的松的方法，所述的CYP-7重組釀酒酵母突變體，發酵轉化底物脫氧可的松并從發酵液萃取產物氫化可的松。

本發明所述C11β-羥化酶CYP-7突變體，可應用于過表達重組基因工程菌以及基于表達突變體的重組工程菌的高效甾體C11β-羥化工藝。

有益效果：