[發明專利]基于虛擬分割方法的生物靶標數字化定量檢測方法

有效

• 申請號: 202010416294.1
• 申請日: 2020-05-17
• 公開（公告）號: CN113687060B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 荊高山;王棟;許俊泉
• 申請（專利權）人: 格物致和生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/76
• 代理公司: 北京漢鼎理利專利代理事務所(特殊普通合伙) 11618
• 代理人: 潘滿根

本發明提供一種基于虛擬分割方法的生物靶標數字化定量檢測方法，所述方法包括用磁珠對待測生物靶標進行處理、富集和捕獲，連接在所述磁珠上的待測生物靶標與中介配體結合，將連接所述中介配體的磁珠隨機平鋪并固定到平面基板上；在所述平面基板上進行所述液相?固相原位發光反應；并且所述平面基板表面事先修飾與所述液相?固相原位發光反應生成的發光分子結合的功能基團；和獲得反應后所述平面基板的數字圖片，然后采用虛擬分割方法，實現待測生物靶標的數字化定量檢測。本發明整個方法所要求的檢測系統大大簡化，檢測耗材和檢測系統成本大大降低，大大拓寬了數字定量技術應用。基于本發明方法，可以實現可靠、靈敏、快速，并且價格低廉的數字化檢測。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體涉及基于基于虛擬分割方法的生物靶標數字化定量檢測方法。

背景技術

體外診斷技術(In?Vitro?Diagnosis，IVD)是在人體之外，通過對人體的樣品(血液、體液、組織等)進行樣品處理、生化反應以及結果檢測，從而獲得臨床診斷信息的技術。體外診斷技術的檢測對象是液體，常規檢測體積1～100ml。液體中的生物、化學物質主要是核酸分子(DNA/RNA)，蛋白分子。體外診斷檢測的主要人體樣品是血液。由于正常人體生物、化學物質在血液中的濃度相對恒定，特定生物、化學物質的濃度變化，可以表征人體是否處于健康狀態。體外診斷過程可以分為以下三個階段。

(一)樣品處理

人體樣品，尤其是血液，含有多種生物、化學物質，例如DNA/蛋白靶分子。需要對樣品進行處理，對待檢測的靶分子進行富集、純化，從而減少人體樣品中其余物質對生化反應和結果檢測的干擾。

(二)生化反應

體外診斷中，經過處理和捕獲的靶分子一般濃度較低。需要經過配體放大反應，增大靶分子物質量或者表征靶分子的物質量。例如，常用的DNA靶分子配體放大反應是PCR反應，通過反應增大待測DNA分子的物質總量；常用的蛋白靶分子配體放大反應是ELISA(酶聯促發反應)，通過反應生成大量化學發光分子用于表征蛋白靶分子，增大蛋白靶分子的檢測信號。

(三)結果檢測

常規生物、化學檢測技術基于光學檢測。經過配體放大反應后，較高濃度的核酸、蛋白光學標記物(例如熒光基團、化學發光物質)通過光學器件檢測，例如光電倍增管(PMT)或者CCD/CMOS成像光學器件。

針對人體樣品(尤其是血液)中痕量靶分子的可靠、靈敏、快速檢測，是目前精準醫學的重大需求。其中，數字化檢測技術是目前的重點研發技術。數字化檢測的核心過程是將待測樣品均勻分配到大量的反應單元中，這些反應單元同時進行生化反應并進行結果檢測。以針對核酸分子檢測的數字PCR技術為例，策略是：將一個待測樣品均勻分配到大量微小的反應單元中；然后，這些微小的反應單元同時進行PCR擴增反應，實現單拷貝或者多拷貝靶序列分子PCR擴增；擴增后，對每個反應單元檢測到的熒光信號設定一個閾值，高于閾值時熒光信號的反應單元判讀為1(“陽性”)，低于閾值時熒光信號的反應單元判讀為0(“陰性”)。理論上講，每個反應單元中靶序列分子(DNA模板)的分配存在三種可能性：零拷貝、一個拷貝或多個拷貝。當反應單元的數目足夠大，大部分反應單元的內部只含有一個拷貝或者零拷貝靶序列分子(近似于泊松分布)，從而實現單拷貝靶序列分子PCR擴增。最后，通過統計陽性和陰性兩種信號類型的反應單元比例和數目，并進行泊松統計學分析，最終計算出原始待測樣本中的靶序列拷貝數。