[發明專利]一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針的構建方法及其產品和應用

在審

• 申請號: 202010415369.4
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111549100A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 查克·特里里;何露·德杰比;周大明;穆罕默德·巴里;孔祥東;石彪;田榮;王德強
• 申請（專利權）人: 中國科學院重慶綠色智能技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發明涉及一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針的構建方法及其產品和應用，屬于分子探針技術領域。本發明提供了一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針，能在保持樣本中初始miRNA數量不變的前提下實現檢測信號的線性放大。由于該探針在檢測過程中無需進行PCR，避免了非特異性擴增，從而提高了檢測的特異性。與傳統的分離方法相比，把磁珠用于生化樣品復雜組分的分離，能夠實現分離和富集的同時進行，有效地提高了分離速度和富集效率，同時也使分析檢測的靈敏度大大提升。

技術領域

本發明屬于分子探針技術領域，具體涉及一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針的構建方法及其產品和應用。

背景技術

癌癥也叫惡性腫瘤，具有增殖異常、生長失去控制、浸潤性和轉移性等生物學特征。它可以破壞組織、器官的結構和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終可能由于器官功能衰竭而死亡。目前，肺癌仍然是最具威脅生命的疾病，由于其發病率和死亡率的居高不下，在世界范圍內越來越普遍。根據國家癌癥中心發布的統計數據，2015年我國新發肺癌患者例數為78.7萬，約占癌癥新患病例的20％。更糟糕的是，未來幾十年，肺癌新增病例數量預計將翻一番，這會給國家社保系統、醫療系統和家庭生活帶來重大負擔。

雖然近幾十年來在診治方面做了很多努力，但肺癌的預后仍然很差，肺癌在5年內生存率低于15％。這主要是由于肺癌診斷時間常在晚期，治療性手術不再作為選擇。因為肺癌在初期的發展非常隱蔽，主要表現為：呼吸短促、咳嗽和體重下降等癥狀，常常也屬于著肺炎癥狀，故肺癌確診是一個難點。傳統的肺癌的早期檢測技術包括胸部X線攝影、低劑量計算機斷層掃描(LDCT)和肺活檢。然而，這些技術在肺癌的早期檢測中存在一些局限性，包括高假陽性率、侵襲性、潛在的過度診斷、過高的成本或輻射誘發的癌癥。另一方面，標準免疫測定法(如ELISA、RIA、IF等)已成為檢測LC生物標志物的成熟技術，但耗時、成本高，只能在集中的實驗室中進行。此外，這些免疫測定法大多為單重測定法，對檢測疾病早期低濃度的生物標志物不夠敏感。所以需要開發一種靈敏度高的早期肺癌檢測技術。

近年來，許多科學家提出了通過標志物來診斷肺癌，其中對miRNA的研究較多。miRNA是一種非編碼RNA，一般是18-25個堿基長度。研究表明，人類約30％的基因受到miRNA的調控，miRNA的表達水平與人類多種疾病的發生密切相關。傳統定量檢測miRNA的方法主要包括Northern blotting、原位雜交、微陣列法、滾環擴增和反轉錄聚合酶鏈反應等。這些方法大體可以歸為無需樣本擴增的探針直接雜交法和基于樣本miRNAs擴增的檢測方法。它們各有優缺點：不經過擴增的方法操作簡便，但對樣本量需求較大，且靈敏度較低；而基于擴增的方法靈敏度較高，但其受限于無法直接檢測miRNAs水平和非特異性擴增。其原因在于miRNAs的序列很短，這些擴增手段及相應的探針設計都需要非常精細和復雜的設計。傳統PCR技術大都通過檢查其前體而進行間接判斷，

因此，現有的診斷方法并不能反映真實的miRNAs水平，并且，miRNAs在體液中的表達量遠低于其在組織中的表達，因此常規檢測組織中miRNAs的技術并不一定適用于體液miRNAs的檢測，需要講究新的能夠增強檢測信號的探針以及方法。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針的構建方法；本發明的目的之二在于提供一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針；本發明的目的之三在于提供一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針在檢測miRNA方面的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1.一種檢測miRNA分子的磁性微球DNA探針的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：

(1)制備DNA探針：根據待測的miRNA分子序列合成與所述miRNA分子配對的DNA探針，所述DNA探針的一端修飾熒光基團，另一端修飾生物素；