[發(fā)明專利]一種模擬結(jié)腸環(huán)境的小型發(fā)酵系統(tǒng)及其發(fā)酵方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010412637.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111676127A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱炫;向沙沙;鄭誼青;包璇;馮瀟;葛茵;張亞林;陳杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類號(hào): C12M1/26
• 分類號(hào): C12M1/26;C12M1/24;C12M1/04;C12M1/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種模擬結(jié)腸環(huán)境的小型發(fā)酵系統(tǒng)，其特征在于包括管路連接的補(bǔ)料瓶（1）、發(fā)酵主體和樣品收集裝置，所述補(bǔ)料瓶（1）上設(shè)有進(jìn)氣口（2），所述發(fā)酵主體包括管路依次連接的第一發(fā)酵支口試管（4）、第二發(fā)酵支口試管（5）和第三發(fā)酵支口試管（6），所述第一發(fā)酵支口試管（4）、第二發(fā)酵支口試管（5）和第三發(fā)酵支口試管（6）上均設(shè)有氣體收集口（10），所述樣品收集裝置包括第一樣品收集器（7）、第二樣品收集器（8）和第三樣品收集器（9），所述補(bǔ)料瓶（1）與第一發(fā)酵支口試管（4）之間的管路、第一發(fā)酵支口試管（4）和第二發(fā)酵支口試管（5）之間的管路、第二發(fā)酵支口試管（5）和第三發(fā)酵支口試管（6）之間的管路以及第三發(fā)酵支口試管（6）與第三樣品收集器（9）之間的管路上均設(shè)有蠕動(dòng)泵（3）。

2.如權(quán)利要求1所述的一種模擬結(jié)腸環(huán)境的小型發(fā)酵系統(tǒng)，其特征在于所述第一發(fā)酵支口試管（4）右側(cè)的蠕動(dòng)泵（3）的右側(cè)設(shè)有三通閥（11），分別連接第一樣品收集器（7）和第二發(fā)酵支口試管（5），所述第二發(fā)酵支口試管（5）右側(cè)的蠕動(dòng)泵（3）的右側(cè)同樣設(shè)有三通閥（11），分別連接第二樣品收集器（8）和第三發(fā)酵支口試管（6）。

3.利用權(quán)利要求1或2所述的小型發(fā)酵系統(tǒng)模擬結(jié)腸環(huán)境發(fā)酵的方法，其特征在于包括以下步驟：

（Ⅰ）對(duì)補(bǔ)料瓶（1）、發(fā)酵主體、樣品收集裝置和新鮮腸道培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，備用；

（Ⅱ）制備糞便提取液，備用；

（Ⅲ）將恒溫?fù)u床打開(kāi)，設(shè)定轉(zhuǎn)速110r/min，溫度37℃，預(yù)熱備用；

（Ⅳ）在超凈臺(tái)內(nèi)將經(jīng)步驟（Ⅰ）滅菌后的模擬結(jié)腸環(huán)境的小型發(fā)酵系統(tǒng)搭建好，使用第一發(fā)酵支口試管（4）模擬升結(jié)腸，第二發(fā)酵支口試管（5）模擬橫結(jié)腸，第三支口發(fā)酵試管（6）模擬降結(jié)腸，在每支發(fā)酵支口試管中添加步驟（Ⅱ）得到的糞便提取液與經(jīng)步驟（Ⅰ）滅菌后的新鮮腸道培養(yǎng)基質(zhì)量比為1：9，采用0.1M NaOH和0.1M HCl調(diào)節(jié)模擬升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸的發(fā)酵支口試管中PH分別為5.8、6.2和6.8，同時(shí)在補(bǔ)料瓶（1）中添加100ml經(jīng)步驟（Ⅰ）滅菌的新鮮腸道培養(yǎng)基后，將發(fā)酵系統(tǒng)密封，再將補(bǔ)料瓶（1）與惰性氣體鋼瓶相連，打開(kāi)惰性氣體鋼瓶和發(fā)酵系統(tǒng)中的各蠕動(dòng)泵（3），向發(fā)酵系統(tǒng)中通惰性氣體除氧10min；

（Ⅴ）除氧結(jié)束后，在各氣體收集口（10）處連接氣體收集袋，最后將該發(fā)酵系統(tǒng)放入經(jīng)步驟（Ⅲ）預(yù)熱的恒溫?fù)u床中進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)，條件為：每12h進(jìn)行一次通惰性氣體除氧10min，樣品收集裝置中液體樣品每24h取一次，氣體收集袋每24h更換一次，補(bǔ)料方式為流加補(bǔ)料，發(fā)酵處理時(shí)間為7d。

4.如權(quán)利要求3所述的一種模擬結(jié)腸環(huán)境的發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟（Ⅰ）中滅菌處理方法為：高壓蒸汽滅菌，條件為121℃，15min。

5.如權(quán)利要求3所述的一種模擬結(jié)腸環(huán)境的發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟（Ⅱ）中糞便提取液的制備方法為：糞便由無(wú)腸道疾病，且半年內(nèi)沒(méi)有使用過(guò)抗生素的20-25歲健康青年提供，捐獻(xiàn)者使用一次性無(wú)菌采樣器收集好糞便后，立即轉(zhuǎn)入在厭氧操作箱，以防厭氧菌接觸空氣死亡，稱取10g糞便與無(wú)菌容器中，加入80 mL無(wú)菌pH6.8的PBS緩沖液，充分?jǐn)嚢钁腋『螅脽o(wú)菌三層紗布過(guò)濾掉固體顆粒，立即置于厭氧環(huán)境中備用。

6.如權(quán)利要求3所述的一種模擬結(jié)腸環(huán)境的發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟（Ⅲ）中模擬升結(jié)腸和降結(jié)腸的第一發(fā)酵支口試管（4）和第三發(fā)酵支口試管（6）中均添加糞便提取液3mL，新鮮腸道培養(yǎng)基27 mL，模擬橫結(jié)腸的第二發(fā)酵支口試管（5）中添加糞便提取液4mL，新鮮腸道培養(yǎng)基36 mL。

7.如權(quán)利要求3所述的一種模擬結(jié)腸環(huán)境的發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟（Ⅴ）中所述流加補(bǔ)料的流速由蠕動(dòng)泵（3）控制。