[發明專利]大黃酸與姜黃素聯用延緩腎纖維化進程差異代謝物代謝通路及研究方法

在審

• 申請號: 202010411088.1
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111855831A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 向錚;馮馮;余茜茜
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 北京中北知識產權代理有限公司 11253
• 代理人: 陳孝政

1.一種大黃酸與姜黃素聯用延緩腎纖維化進程差異代謝物代謝通路及研究方法，其特征在于：包括采用超高效液相色譜串聯質譜檢測NRK-49F細胞纖維化和單側輸尿管結扎誘發的腎纖維化及大黃酸與姜黃素聯用干預后的內源性代謝產物，獲得指紋圖譜；

利用多元統計分析方法，從多個變量中篩選并鑒定出8顯著發生變化的代謝物，作為與腎纖維化發生潛在相關差異代謝物；

通過Metaboanalyst富集出與腎纖維化相關的3條代謝通路。

2.根據權利要求1所述的一種大黃酸與姜黃素聯用延緩腎纖維化進程差異代謝物代謝通路及研究方法，其特征在于：獲得大黃酸與姜黃素聯用延緩腎纖維化的差異代謝物代謝通路的具體步驟如下：

(1)大黃酸與姜黃素的制備：將大黃酸25mg/kg和姜黃素25mg/kg溶解在CMC-Na制備；

(2)模型的確定：NRK-49F細胞培養于含10％胎牛血清、1％青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養基中，置于37℃、5％CO₂、飽和濕度的細胞培養箱中；TGF-β1溶于過濾的蒸餾水中至濃度為50mg/mL，并將其儲存在-20℃；在每次實驗之前，將TGF-β1的儲備溶液用含有2mg/mLBSA的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋至10ng/mL；雄性SD大鼠18只，每組6只，共3組，體重220-250g，將SD大鼠隨機分別為sham組、UUO模型組、大黃酸與姜黃素聯合給藥組；

UUO模型的建立：模型組和給藥組進行單側輸尿管結扎手術，用10％的水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉后，將大鼠手術處剃毛，豎切口打開腹腔，找到腎臟后小心分離輸尿管將兩端結扎，中間剪斷；假手術組只分離但不結扎；

(3)取對數生長期NRK-49F細胞胰蛋白酶消化后，將約7.5×10⁵個/孔NRK-49F細胞接種到6孔板中；24小時后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培養基將細胞饑餓過夜使細胞同步，后隨即分為3組(n＝8)對照組、模型組10ng/mL TGF-β1、大黃酸與姜黃素聯用組5ng/mL+5μM在37℃和5％CO₂下48小時；快速棄去培養基，加入1mL冷PBS快速洗滌細胞3次，加入1mL-80℃預冷的提取劑淬滅，用細胞刮刀收集細胞后，采用超聲波細胞破碎儀進行破碎30min，12000rpm，4℃，離心20min后收集細胞上清液，待測；對于大鼠，術后七天處死，處死前收集大鼠12小時尿液，取樣品，25℃解凍后進行甲醇沉淀蛋白前處理，尿液按樣品：甲醇＝1：5的比例加入甲醇，渦旋混合30s后，4500rpm離心10min，取上清液待測；

(4)細胞和尿液樣本的超高效液相色譜串聯質譜檢測分析；

(5)將從UPLC-Q-TOF獲得的原始數據導入Progenesis QI ver.2.2(NonlinearDynamic)進行峰對齊、解卷積和歸一化等處理；

(6)利用多元變量統計分析代謝輪廓差異；采用SIMCA(version 14.0)對細胞和尿液代謝組學不同組別數據進行多元統計分析，包括主成分分析PCA和正交偏最小二乘法判別分析OPLS-DA；通過載荷圖代謝物的變量權重重要性排序variable importance in theprojection,VIP，進一步篩選離子；采用IBM SPSS(version 22.0,IBM Corporation,USA)軟件進行t檢驗分析和ROC曲線分析；采用GraphPad Prism軟件進行箱式圖分析；

(7)篩選潛在生物標志物以空白組和模型組預處理后的超高效液相色譜和質譜檢測數據建立正交偏最小二乘法分析模型OPLS-DA，對兩組間的差異代謝物進行篩選，采用SPSS22.0軟件進行統計學處理；差異代謝物的篩選條件為：選擇變量VIP1，且差異在兩組間具有統計學意義；

(8)潛在生物標志物的鑒定對篩選出的離子通過QI軟件自帶的HMDB和LIPD MAPS數據庫進行結構鑒定；最終共鑒定8與腎纖維化發生相關的差異代謝產物；

(9)代謝通路富集分析：將細胞和尿液鑒定出的差異代謝產物上傳到Metaboanalyst代謝組學分析網站，將代謝產物名字標準化后，選擇KEGG數據庫，進行相關通路的富集；最后運用Metabo Analyst 4.0平臺對差異代謝物進行代謝通路富集；共富集得到3條代謝通路：甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝。