[發明專利]禽流感病毒H7N9亞型N蛋白IgY抗體檢測膠體金試紙及方法

有效

• 申請號: 202010410001.9
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111551745B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 卞傳忠
• 申請（專利權）人: 安徽中起生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532;B22F9/24
• 代理公司: 合肥中谷知識產權代理事務所(普通合伙) 34146
• 代理人: 洪玲

1.一種禽流感病毒H7N9亞型N蛋白IgY抗體檢測膠體金試紙，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特征在于，所述結合墊為包被有兔抗雞IgG-膠體金復合物的膠體金墊，所述硝酸纖維素膜上設有由山羊抗兔IgG包被的質控線和H7N9重組抗原包被的檢測線，且檢測線上包被2種H7N9重組抗原；

膠體金試紙制備方法包括以下步驟：

（1）制備純化的H7N9重組抗原：根據H7N9重組抗原H7N9-A，H7N9-B蛋白基因序列制備H7N9亞型N蛋白的大腸桿菌重組菌，其中NC_026426.1基因編碼蛋白的信號肽后60個氨基酸對應的基因序列作為H7N9-A重組抗原的基因序列，60個氨基酸后面剩下的氨基酸對應的基因序列作為H7N9-B重組抗原的基因序列，將重組菌進行發酵表達并離心獲得菌體，將菌體超聲破碎，離心后取上清，將上清液過親和層析柱，即為純化的H7N9-A，H7N9-B重組抗原；

（2）制備硝酸纖維素膜：將山羊抗兔IgG和純化的H7N9重組抗原分別以50mM的Tris-NaCl緩沖液稀釋至終濃度為1mg/ml，再以0.75μL/cm的噴量噴施包被在質控線和檢測線上，充分干燥；

（3）制備膠體金：采用檸檬酸三鈉還原法，步驟包括：

（Ⅰ）取質量分數為?0.005％-0.015％的HAuCl₄水溶液100ml，加熱煮沸；

（Ⅱ）迅速加入質量分數為0.5％-5％的檸檬酸三鈉水溶液1ml，繼續煮沸，溶液由淡黃色變成灰色，繼而轉成黑色，隨后逐漸穩定成酒紅色，制成膠體金溶液；

（4）膠體金標記兔抗雞IgG：步驟包括：

（i）取兔抗雞IgG溶于0.1-0.2ml?10mM的緩沖液中，將膠體金溶液的pH值調至7.2；

（ii）每20-50mg兔抗雞IgG中，加入10ml膠體金溶液；

（iii）混合3-5min后，加入質量分數為0.05%的BSA，室溫作用結合15min；

（iv）先2000r/min低速離心15min，再12000r/min高速離心25min；

（v）用100mmol/L的pH7.8的含0.2%質量分數Proclin300的緩沖液重懸沉淀，獲得兔抗雞IgG-膠體金復合物；

（5）制備膠體金墊：將兔抗雞IgG-膠體金復合物均勻噴在結合墊上，充分干燥，獲得膠體金墊；

（6）樣品墊的處理：將樣品墊浸泡在20mmol/L的PBS緩沖液中2-5小時，并且邊震蕩邊混勻，其中緩沖液中加入活化劑；浸泡結束后，將樣品墊放入烘箱中烘干；

（7）組裝：在干燥環境下，將樣品墊、膠體金墊、包被好的硝酸纖維素膜和吸水墊粘貼在PVC板上，裁切后，獲得試紙。

2.一種利用如權利要求1所述的禽流感病毒H7N9亞型N蛋白IgY抗體檢測膠體試紙檢測禽流感病毒H7N9亞型N蛋白IgY抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、將試紙平放，取待測血清樣品50-100μL，加入樣品墊；

步驟二、室溫靜置15min后，判斷：若質控線出現紫紅色線且檢測線不出現色線，為陰性；若質控線和檢測線都出現紫紅色線，為陽性；檢測線的顏色深淺與抗體滴度成正比。