[發明專利]體外激活擴增人體自然殺傷細胞及殺傷率檢測方法

有效

• 申請號: 202010405488.1
• 申請日: 2020-05-14
• 公開（公告）號: CN111690606B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 林鈺庭;林高坤;接振旺
• 申請（專利權）人: 蘇州厚樸惠康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12Q1/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及一種體外激活擴增人體自然殺傷細胞的方法，包括：步驟一：分離外周血單個核細胞；步驟二：取步驟一中獲得的單個核細胞于無血清培養基中以0.5*10supgt;6/supgt;細胞/mL的濃度進行培養，并加入500U/mL的rhIL?2；步驟三：在培養的0?5天向培養基中加入CD3抗體和CD16抗體，并將最終濃度調整至10ng/mL，在培養的第5天將含有CD3抗體的培養基沖洗干凈，并加入含有500U/mL的IL?2、10ng/mL的IL7、10ng/mL的IFN?γ、30ng/mL的HGF和無血清免疫細胞培養基進行細胞培養；步驟四：進行NK細胞的計數統計。本發明的擴增方法能夠更加迅速且簡便的進行擴增，提高增殖率。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種體外激活擴增人體自然殺傷細胞及殺傷率檢測方法。

背景技術

自然殺傷(natural?killer?cell，NK)細胞占人外周血淋巴細胞的5％至20％，其來源于CD34+造血祖細胞，是T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，是人體免疫系統的第一道防線，在機體抗病毒感染和抗腫瘤免疫中起重要作用。NK細胞成熟的確切生理部位和驅動其功能特征發展的機制尚未完全闡明，但最近的研究表明，這些發生在骨髓和淋巴結中。

NK細胞具有大顆粒淋巴細胞的形態，并且在表型上由CD56的表達以及CD3和T細胞受體分子的缺乏來定義，大約10％的NK細胞表達非常高水平的CD56，并且還具有與IgG的Fc部分結合的受體FcgRIII(CD16)的暗淡表達。多數認為這部分細胞主要通過分泌細胞因子和趨化因子發揮免疫調節作用，盡管在血液、骨髓和脾臟中較少見，但該細胞亞群在次級淋巴組織中占主導地位。血液中剩余的90％NK細胞表達較低水平的CD56和較高水平的CD16，這部分細胞似乎主要在直接細胞毒性和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)中起作用，NK細胞可以通過穿孔素顆粒酶途徑或在其細胞表面表達死亡受體配體來直接誘導凋亡，這些配體包括與腫瘤壞死因子(TNF)?相關的凋亡誘導配體(TRAIL)或Fas配體，它們通過各自的受體直接觸發細胞凋亡。

NK細胞可以殺死靶細胞，而無需事先敏化，這種作用由刺激信號和抑制信號進行平衡調節，NK細胞表面上的許多信號受體都與主要的組織相容性復合物MHCⅠ類和MHCⅡ類分子結合。眾所周知的機制是通過增加靶細胞中I類MHC或人類白細胞抗原(HLA)的表達來抑制NK活性，NK細胞表達殺傷性免疫球蛋白樣受體(KIR)，其中大多數識別靶細胞上特定的相應HLA?I類分子，并傳遞抑制信號，而來自HLA的這些抑制信號可能會覆蓋激活信號并抑制NK細胞的功能。最近出現的一個概念是，NK細胞和HLA分子之間的相互作用對于它們的功能成熟以及對自身分子具有耐受性的NK細胞的產生也可能很重要，這一過程被稱為“許可”。

目前，體外擴增NK系統主要通過以下三種方法：1、采用飼養細胞(基因修飾)的方法培養PBMC中的NK細胞；2、采用免疫磁珠的方法從PBMC中將NK細胞分離出來再培養；3、單純的細胞因子組合刺激PBMC中NK細胞的擴增。采用飼養細胞培養NK細胞可以獲得高純度大量的NK細胞，但引入了人源細胞，存在安全隱患；采用免疫磁珠的方法可以快速的獲得少量NK細胞，但只能用于NK細胞研究，量少不適用于臨床，且成本高，操作復雜；現有的細胞因子組合刺激PBMC中NK細胞的擴增的方法僅能使NK細胞擴增倍數在150倍左右，NK細胞純度在60％左右，且數量和純度上都無法滿足治療性的要求。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種體外激活擴增人體自然殺傷細胞及殺傷率檢測方法，具有可大量擴增活力、品質、毒殺活性較佳的NK?細胞的優點。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：

一種體外激活擴增人體自然殺傷細胞的方法，包括：

步驟一：分離外周血單個核細胞，并用磷酸鹽緩沖液洗滌；