[發明專利]一種分離培養番茄根系微生物組的方法及所得番茄根系微生物組

在審

• 申請號: 202010401436.7
• 申請日: 2020-05-13
• 公開（公告）號: CN111518730A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 白洋;張婧贏;劉永鑫;曲寶原
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;C12N1/02;C12Q1/6869;C12Q1/04;C05G3/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 莫舒穎

本發明提供了一種分離培養番茄根系微生物組的方法，其為I、取番茄根系研磨獲得根系漿狀物，梯度稀釋培養得到培養細菌；II、培養細菌16S rRNA基因的V5?V7區域序列測序；III、細菌OTU的鑒定并得到不同門和/或高豐度屬的包含的培養細菌數的比例；IV、依據上述比例構建番茄根系微生物組。本發明還提供所得的番茄根系微生物組，以及分離培養番茄根系微生物組的方法和番茄根系微生物組的應用。本發明的方法能夠快速高效的分離培養番茄根系微生物組，為利用原位根系微生物制成菌肥提供了良好的資源。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中一種分離培養番茄根系微生物組的方法及所得番茄根系微生物組。

背景技術

番茄又名為西紅柿，是世界上需求量最多的蔬菜之一。隨著番茄產業規模的變化，番茄種植業也存在著許多亟待解決的問題，主要為番茄產品質量安全問題。為了維持大量蔬菜供給，壽光大棚蔬菜種植用地使用頻繁，施用大量的化肥和農藥，蔬菜農藥殘留嚴重，病害頻發，同時農戶在種植過程中安全意識不強，導致番茄生產安全隱患。在連續種植的土地負荷下，3-5年需要進行大棚熏蒸消毒或更換土壤，且非嫁接苗難以成活，只能種植嫁接番茄苗，這種做法不但成本極高，而且不可持續。因此，蔬菜產業的可持續發展應以良好的生態環境為基礎，采用綠色環保、科學精準的蔬菜種植體系必然為蔬菜產業的發展提供契機。

微生物是土壤生態環境中最大的居民，土壤中的微生物能分解土壤中的動植物殘體，形成腐殖質，為植物提供最豐富、最全面的植物營養來源。同時，微生物與根系、根際土壤一起組成了農作物的“腸胃”，很多有益微生物與根系形成互補共生關系，在農作物各種營養的轉化和吸收過程中發揮主要作用，多數礦物質元素依靠微生物的活動變為農作物可吸收的活性狀態。同時，有益微生物是農作物的衛士，協助抵抗病蟲侵害。比如，膠質芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等可以將不可溶磷、鉀轉化為可溶的磷、鉀活性狀態，便于植物吸收；根瘤菌能將空氣中的氮加工成可供植物吸收的氨態氮，源源不斷地輸送給植物，形成植物的天然氮工廠。正是微生物的這些功能，造就了微生物菌肥在農業領域引起的高度關注。然而，目前的菌肥都以單一菌種為主，在不同作物、不同時期、不同用量情況下的效果不穩定，主要原因是外源菌種在不同土壤性質的適應性及對作物產生作用的特異性。

微生物組學研究動植物體上共生或病理的微生物生態群體。微生物組包括細菌、古菌、原生動物、真菌和病毒。因此，利用根系微生物組分離技術，培養番茄根系的原位微生物組，可從根本上解決規模番茄種植成本極高且不可持續的問題，同時克服了現有番茄用菌肥單一菌種不穩定性的缺陷。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何針對番茄規模化栽培過程中根際微生物菌群失調，種植成本極高且不可持續的問題，以及現有番茄用菌肥單一菌種不穩定的問題，提供一種分離培養番茄根系微生物組的方法及所得番茄根系微生物組。

本發明的一種分離培養番茄根系微生物組的方法，包括如下步驟：

I、取番茄根系加入10mM MgCl₂溶液研磨獲得根系漿狀物；梯度稀釋根系漿狀物，每個稀釋倍數的根系漿狀物以N張96孔細胞培養板培養，每日觀察，直至板上渾濁的孔不再增加為止；留30-50％的孔內渾濁的稀釋倍數，該稀釋倍數的每塊板上每個渾濁孔內的菌液即為培養細菌；每孔培養細菌取部分菌液進行下一步細菌鑒定，剩余的菌液分別低溫保存；所述N為大于等于2的自然數；

II、將每孔培養細菌分別提取模板DNA后，采用兩輪標記引物的聚合酶鏈式反應技術擴增后結合Illumina Hiseq測序得出每孔培養細菌的16S rRNA基因的V5-V7區域序列；

所述兩輪標記引物的聚合酶鏈式反應技術，第一輪使用無Barcode的799F和1193R作為引物，第二輪使用799F-2和1193R-2作為引物；

所述799F為核苷酸序列是序列1的單鏈DNA，所述1193R為核苷酸序列是序列2的單鏈DNA，所述799F-2和1193R-2選自下述A或B的引物：