[發(fā)明專利]一種作物根系微生物組高通量分離培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010401434.8
• 申請日: 2020-05-13
• 公開（公告）號: CN111518729A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白洋;張婧贏;劉永鑫;曲寶原
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12Q1/04
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 莫舒穎

1.一種作物根系微生物組高通量分離培養(yǎng)方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

S1、在無菌條件下，研磨作物根系得到作物根系勻漿物，采用梯度稀釋法稀釋所述作物根系勻漿物得到多個稀釋度樣品，將每個稀釋度樣品在N張96孔板上培養(yǎng)，直至所有稀釋度樣品的渾濁的孔數(shù)目不再增加為止；留渾濁的孔數(shù)占對應(yīng)稀釋度樣品接種的總孔數(shù)比例為30-50％的稀釋度樣品培養(yǎng)得到的渾濁孔，每個渾濁孔內(nèi)的液體含有細(xì)菌，將所述每個渾濁孔內(nèi)的液體命名為培養(yǎng)細(xì)菌；所述N為大于等于2的自然數(shù)；

S2、在無菌條件下，提取每個所述培養(yǎng)細(xì)菌的基因組DNA；

S3、在無菌條件下，將每個所述培養(yǎng)細(xì)菌的基因組DNA作為模板，以799F和1193R為引物，分別進行PCR擴增16S rRNA基因V5-V7片段，將該PCR稱為第一步PCR；將得到的第一步PCR產(chǎn)物作為模板，以799F-2和1193R-2為引物進行PCR擴增16S rRNA基因V5-V7片段，將該PCR稱為第二步PCR；收集每個所述培養(yǎng)細(xì)菌的第二步PCR產(chǎn)物并進行混合得到所有培養(yǎng)細(xì)菌的第二步PCR產(chǎn)物混合物，將該混合物稱為培養(yǎng)細(xì)菌鑒定文庫；

所述799F為核苷酸序列是序列1的單鏈DNA，所述1193R為核苷酸序列是序列2的單鏈DNA，所述799F-2和1193R-2選自下述A或B的引物：

A、所述799F-2為在所述799F上連接Illumina測序所需序列以及96個孔barcode中的一種得到的96種單鏈DNA，所述1193R-2為在所述1193R上連接Illumina測序所需序列以及M個板barcode中的一種得到的M種單鏈DNA；

B、所述799F-2為在所述799F上連接Illumina測序所需序列以及M個板barcode中的一種得到的M種單鏈DNA，所述1193R-2為在所述1193R上連接Illumina測序所需序列以及96個孔barcode中的一種得到的96種單鏈DNA；

所述96個孔barcode是用于標(biāo)記在一張96孔板上的96個孔的標(biāo)記，所述96個孔barcode的核苷酸序列均不相同，所述M個板barcode是用于標(biāo)記所述N張96孔板的標(biāo)記，所述M個板barcode的核苷酸序列均不相同；所述M為大于等于所述N的自然數(shù)；

S4、對所述培養(yǎng)細(xì)菌鑒定文庫進行測序，將測序所得的序列與RDP數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA基因V5-V7片段列進行比對，得到作物根系細(xì)菌OTU，將所述作物根系細(xì)菌OTU對應(yīng)的所述培養(yǎng)細(xì)菌進行保存；

S5、在無菌條件下，依據(jù)所有所述培養(yǎng)細(xì)菌所屬的細(xì)菌OTU，得出屬于不同門和/或高豐度屬的所述培養(yǎng)細(xì)菌的比例，按照所述比例將保存的培養(yǎng)細(xì)菌復(fù)蘇后混合，得到作物根系微生物組。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述N為25-60的自然數(shù)，具體為45。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述作物為單子葉植物或雙子葉植物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于：所述S1中，培養(yǎng)在室溫進行。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于：所述S1中，用1/10×TSB液體培養(yǎng)基采用梯度稀釋法稀釋所述作物根系勻漿物；所述1/10×TSB液體培養(yǎng)基是由溶質(zhì)和溶劑組成的pH為7.3±0.2液體，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)濃度為胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鉀2.5g/L、葡萄糖2.5g/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于：所述S4中，采用Hiseq 2500平臺進行測序。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于：所述S4中，根據(jù)所述孔barcode和所述板barcode對序列進行質(zhì)量過濾和樣本拆分，得到作物根系細(xì)菌OTU。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于：所述微生物組為細(xì)菌。