[發(fā)明專利]腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法及測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010394554.X
• 申請日: 2020-05-11
• 公開（公告）號: CN111593071A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王浩;王文芝;陳瑩;李明偉
• 申請（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/65;C12N15/12;G01N33/68;G01N33/573;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 馬金華

1.一種腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法包括：

第一步，以3×Tg-AD小鼠作為AD模型，10月齡3×Tg-AD雄鼠，隨機(jī)分為模型組，實驗組，以同月齡具有相同遺傳背景的雄性C57BL/6J作為對照組；

第二步，AD模型注射攜帶PLTP基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報告基因的腺相關(guān)病毒AAV-PLTP-EGFP，誘導(dǎo)PLTP的高表達(dá)；

第三步，對照組與模型組均注射不攜帶PLTP基因只攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報告基因的腺相關(guān)病毒AAV-EGFP。

2.如權(quán)利要求1所述的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法10月齡3×Tg-AD雄鼠24只，隨機(jī)分為模型組12只，實驗組12只。

3.如權(quán)利要求1所述的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法，其特征在于，所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法以同月齡具有相同遺傳背景的雄性C57BL/6J作為對照組12只。

4.一種由權(quán)利要求1～3任意一項所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型構(gòu)建方法構(gòu)建的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型。

5.一種如權(quán)利要求4所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型在治療阿爾茨海默病靶點中的用途。

6.一種如權(quán)利要求4所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法，其特征在于，所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法包括：

第一步，以3×Tg-AD小鼠作為AD模型，構(gòu)建腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型；

第二步，觀察PLTP過表達(dá)對3×Tg-AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響；

第三步，病理學(xué)觀察PLTP過表達(dá)對3×Tg-AD小鼠的保護(hù)作用；

第四步，觀察PLTP過表達(dá)對Aβ及其生成相關(guān)蛋白的影響；

第五步，觀察PLTP過表達(dá)對總Tau蛋白及其pTau蛋白的影響；

第六步，觀察PLTP過表達(dá)對GSK-3β及GSK-3β的影響；采用western blot檢測GSK-3β及GSK-3β的蛋白表達(dá)水平。

7.如權(quán)利要求6所述的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法，其特征在于，所述第二步觀察PLTP過表達(dá)對3×Tg-AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響；小鼠側(cè)腦室注射AAV-PLTP-EGFP病毒2周后，水迷宮實驗與穿梭被動回避實驗檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；水迷宮實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，以小鼠尋找平臺的潛伏期、進(jìn)入平臺的次數(shù)為指標(biāo)評價認(rèn)知功能；穿梭被動回避實驗在明暗穿梭箱中進(jìn)行，以小鼠進(jìn)入暗箱的潛伏期及在暗箱中的停留時間為指標(biāo)，評價學(xué)習(xí)記憶能力。

8.如權(quán)利要求6所述的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法，其特征在于，所述第三步病理學(xué)觀察PLTP過表達(dá)對3×Tg-AD小鼠的保護(hù)作用；通過HE染色與尼氏染色檢測各組病理學(xué)損傷，通過Aβ₁-42免疫組化染色觀察各組老年斑SP的變化，通過Bielschowsky銀染觀察各組神經(jīng)纖維纏結(jié)NFT的變化。

9.如權(quán)利要求6所述的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法，其特征在于，所述第四步觀察PLTP過表達(dá)對Aβ及其生成相關(guān)蛋白的影響；行為學(xué)實驗后，處死小鼠，分離小鼠大腦皮質(zhì)及海馬，制備其組織勻漿，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測與Aβ生成相關(guān)蛋白APP、PS1、BACE1的表達(dá)水平；ELISA法檢測Aβ_1-40及Aβ_1-42水平。

10.如權(quán)利要求6所述的腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法，其特征在于，所述第五步觀察PLTP過表達(dá)對總Tau蛋白及其pTau蛋白的影響；采用western blot檢測大腦皮質(zhì)及海馬總Tau蛋白及pTau蛋白在pSer199、pSer214、pThr231、pSer404四個磷酸化位點的蛋白的表達(dá)；

所述腦組織特異性PLTP過表達(dá)模型的測定方法的數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，多組樣本間比較采用單因素方差分析ANOVO，P0.05時具有統(tǒng)計學(xué)差異。