[發明專利]一種優化的擴增目標核酸的方法及應用

在審

• 申請號: 202010394310.1
• 申請日: 2020-05-11
• 公開（公告）號: CN111518873A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 楊國華;郭志偉;林國旻;車彬;余佳佳;李杰
• 申請（專利權）人: 南京君華基因科技有限公司;上海羿鳴生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12P19/34
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 侯莉

1.一種優化的擴增目標核酸的方法，包括下述步驟：

在反應體系中，以目標核酸分子為模板，加入引物，具有高摻入率的dNTP-DNA聚合酶復合體系，經擴增反應得到所述目標核酸的擴增產物；

其特征在于，

所述高摻入率的dNTP-DNA聚合酶復合體系包括dNTP和DNA聚合酶；

所述dNTP是至少部分經標記分子修飾的dNTP，當DNA聚合酶含N端結構域的定點突變時，所述經標記分子修飾的dNTP中的修飾基團與dNTP堿基基團連接的前3個C原子內含有或不含有阻止修飾基團分子旋轉的二鍵或三鍵結構；當DNA聚合酶不含N端結構域的定點突變時，所述經標記分子修飾的dNTP中的修飾基團與dNTP堿基基團連接的前3個C原子內不含有阻止修飾基團分子旋轉的二鍵或三鍵結構；

所述DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的高保真聚合酶。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述DNA聚合酶是Pfu，Deep Vent，KOD中的一種或多種；和/或，

所述DNA聚合酶是由Pfu，Deep Vent，KOD中的一種或多種經過改造得到；

所述經標記分子修飾的dNTP是dATP，dCTP，dGTP中的一種或多種；當DNA聚合酶含V93Q突變時，所述經標記分子修飾的dNTP中的修飾基團與dNTP堿基基團連接的前3個C原子內含有或不含有阻止修飾基團分子旋轉的二鍵或三鍵結構；當DNA聚合酶不含V93Q突變時，所述經標記分子修飾的dNTP中的修飾基團與dNTP堿基基團連接的前3個C原子內不含有阻止修飾基團分子旋轉的二鍵或三鍵結構；

所述標記分子是生物素；

所述擴增是單鏈線性擴增。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，

所述含有生物素的修飾基團與所述dATP結合的位點是堿基的N6或7-Deaza；

優選的，當所述含有生物素的修飾基團與所述dATP結合的位點是堿基的N6時，所述經生物素修飾的dATP是biotin-7-dATP，或biotin-14-dATP，其結構式如下所示；

當所述含有生物素的修飾基團與所述dATP結合的位點是堿基的7-Deaza時，所述經生物素修飾的dATP是biotin-11-dATP，其結構式如下所示；

和/或，所述含有生物素的修飾基團與所述dCTP結合的位點是堿基的N4或C5；

優選的，當所述含有生物素的修飾基團與所述dCTP結合的位點是堿基的N4時，所述經生物素修飾的dCTP是biotin-14-dCTP，其結構式如下所示；

當所述含有生物素的修飾基團與所述dCTP結合的位點是堿基的C5時，所述經生物素修飾的dCTP是biotin-11-dCTP或biotin-16-dCTP，其結構式如下所示；

和/或，所述含有生物素的修飾基團與所述dGTP結合的位點是堿基的7-Deaza；

優選的，所述經生物素修飾的dGTP是biotin-11-dGTP，其結構式如下所示；

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，

所述改造是在DNA聚合酶上加一段雙鏈DNA結合結構域；

優選的，所述改造是在DNA聚合酶的C端加一段Sso7d結構域；

更優選的，所述改造是在Pfu聚合酶的C端加一段Sso7d結構域形成加尾體1；或，所述改造是在KOD聚合酶的C端加一段Sso7d結構域形成加尾體2；或，所述改造是將Pfu和DeepVent聚合酶進行嵌合后在C端加一段Sso7d結構域形成嵌合體1。