[發(fā)明專利]一種重組質(zhì)粒和重組工程菌及其構(gòu)建方法和提高D-阿洛酮糖的產(chǎn)量的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010380209.0
• 申請日: 2020-05-08
• 公開（公告）號(hào): CN111733175A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚丹;劉禹佳;房欣蕾;樊沛瑤;余韞;盧曉云
• 申請（專利權(quán)）人: 西安交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/04;C12N9/90;C12R1/19
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發(fā)明公開了一種重組質(zhì)粒和重組工程菌及其構(gòu)建方法和提高D?阿洛酮糖的產(chǎn)量的應(yīng)用，屬于酶定向進(jìn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)了定向進(jìn)化的重組質(zhì)粒，該定向進(jìn)化的重組質(zhì)粒便可視作一基因電路，即DTE酶效率的基因電路。與此同時(shí)，并本發(fā)明還公開了基于上述重組質(zhì)粒構(gòu)建得到的重組工程菌，具體為大腸桿菌E.coli DH5αpSB1C3?psiR?pPsi?EGFP?cp?kanR?DTE。本發(fā)明的上述基因電路使用阻遏蛋白PsiR與其對應(yīng)啟動(dòng)子pPsi實(shí)現(xiàn)了D?阿洛酮糖的生物傳感器；使得菌體可感應(yīng)體內(nèi)D?阿洛酮糖的生產(chǎn)量以表達(dá)不同水平的抗生素抗性基因，從而將DTE酶的效率轉(zhuǎn)化為菌體的生存優(yōu)勢。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶定向進(jìn)化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組質(zhì)粒和重組工程菌及其構(gòu)建方法和提高D-阿洛酮糖的產(chǎn)量的應(yīng)用。

背景技術(shù)

D-阿洛酮糖是天然少量存在的稀有單糖，是果糖的C-3差向異構(gòu)體。作為一種稀有糖，其口感較好且后味不苦，是一種新型甜味劑。在10％的稀釋濃度下， D-阿洛酮糖是蔗糖70％的甜度，但僅有其0.3％的熱量。是蔗糖的理想替代物。D-阿洛酮糖可抑制腸道α-糖苷酶與肝臟產(chǎn)脂酶，可抑制脂肪的積累。D-阿洛酮糖具有血糖抑制功能。在飲食中補(bǔ)充阿洛酮糖可緩解餐后血糖升高并增強(qiáng)對胰島素的敏感性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也報(bào)道了D-阿洛酮糖對于Ⅱ型糖尿病具有保護(hù)作用。相比于D-果糖與D-葡萄糖，D-阿洛酮糖還原性更高，更易引發(fā)美拉德反應(yīng)，以調(diào)節(jié)糕點(diǎn)的顏色并增加風(fēng)味。D-阿洛酮糖還具有神經(jīng)保護(hù)作用，對于神經(jīng)退行性疾病具有潛在的醫(yī)療價(jià)值。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，D-阿洛酮糖可被小腸吸收，但幾乎在體內(nèi)不被代謝，而隨尿液排出。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，長期施加3％阿洛酮糖喂養(yǎng)并未產(chǎn)生明顯的副作用。D-阿洛酮糖在2011年被FDA批準(zhǔn)為“GRAS”(通常視為安全)。

由于天然產(chǎn)量極低且化學(xué)生產(chǎn)工藝復(fù)雜，D-阿洛酮糖的工業(yè)生產(chǎn)一般使用生物發(fā)酵方法。D-塔格糖差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.31,D-tagatose-3-epimerase,DTE酶) 家族催化D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，是工業(yè)生產(chǎn)D-阿洛酮糖的關(guān)鍵酶。 DTE酶家族包含數(shù)種來源的酶，其最適底物、酶效率、最適pH與溫度和金屬離子輔因子也各不相同。其中發(fā)現(xiàn)最早的來源于Pseudomonas cichorii ST-24菌株，其最適底物為D-塔格糖，因此被命名為DTE酶。隨后被發(fā)現(xiàn)的來源于 Agrobacterium tumefaciens的DTE酶家族成員特異性催化D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，被命名為DPE酶(D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶)。DTE酶家族在Rhodobactersphaeroides SK011，Clostridium cellulolyticum H10等菌株中也被發(fā)現(xiàn)與表征。使用未經(jīng)改造的天然DTE酶以D-果糖為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖，其平衡轉(zhuǎn)化率在30％上下，因此在產(chǎn)率上有較大的提升空間。且天然DTE酶的最適pH 均為弱堿性，但發(fā)酵生產(chǎn)D-阿洛酮糖要求酸性環(huán)境以減少美拉德反應(yīng)的發(fā)生，因此如何工程改造DTE酶的最適pH也是一重要方向。

合成生物學(xué)是一門研究生物系統(tǒng)工程化設(shè)計(jì)的學(xué)科。該學(xué)科注重將理性設(shè)計(jì)、系統(tǒng)建模與工程中的概念，如模塊化、標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)等引入傳統(tǒng)的基因工程。定向進(jìn)化與生物傳感器是合成生物學(xué)中兩項(xiàng)重要的使能技術(shù)。定向進(jìn)化模仿達(dá)爾文式自然選擇，用于優(yōu)化某一特定的生物特性，如某一種酶、某一代謝通路乃至優(yōu)化整個(gè)生命體。定向進(jìn)化的優(yōu)勢在于對目標(biāo)系統(tǒng)的知識(shí)不充分的情況下優(yōu)化系統(tǒng)的特性，從而大大加快合成生物學(xué)設(shè)計(jì)、測試、構(gòu)建這一循環(huán)的速度。但定向進(jìn)化中突變文庫的構(gòu)建方式、表型的呈現(xiàn)方式與篩選通量等往往制約著該技術(shù)的應(yīng)用；如何從一多樣化的種群中篩選最適的個(gè)體是定向進(jìn)化的核心問題之一。近年來，合成生物學(xué)技術(shù)與理念的發(fā)展使得研究者得以構(gòu)建比以往更復(fù)雜的工程菌以及工程細(xì)胞。隨著工程菌或工程細(xì)胞復(fù)雜度的增加，其中插入的DNA片段，如質(zhì)粒等也變得更加復(fù)雜，且其傾向于由若干已被研究報(bào)道的、模塊化的DNA片段所組成。因此，這些由合成生物學(xué)啟示的插入DNA片段或插入質(zhì)粒往往被形象地稱作“基因電路“。