[發明專利]miRNA表達載體及其應用

有效

• 申請號: 202010375648.2
• 申請日: 2020-05-07
• 公開（公告）號: CN111560392B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 劉曉萍;羅靄玲;徐令;江華;劉曉丹;楊旭;蔡蔓斯
• 申請（專利權）人: 廣州市婦女兒童醫療中心(廣州市婦幼保健院;廣州市兒童醫院;廣州市婦嬰醫院;廣州市婦幼保健計劃生育服務中心)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N15/113;A61K31/713;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 戴志攀

本發明涉及一種miRNA表達載體及其應用，所述miRNA表達載體從5’端到3’端依次具有以下元件：第一啟動子、目標序列、第二啟動子和線粒體定位序列，所述目標序列由待表達miRNA的DNA序列重復多次得到。通過實驗測試證明，相比于已知載體，利用本申請的miRNA表達載體能夠使待表達miRNA在宿主細胞的線粒體中定向顯著表達，從而有助于調節線粒體中miRNA的表達，實現線粒體功能調控，為靶向線粒體的藥物開發提供基礎。

技術領域

本發明涉及生化分子技術領域，特別是涉及一種miRNA表達載體及其應用。

背景技術

線粒體是胞漿中的具有雙層膜結構的細胞器，是細胞氧化磷酸化合成ATP的場所。線粒體參與真核細胞分化、能量代謝、信號傳導、鈣離子穩態、活性氧生成、凋亡及衰老等功能的調控。

膠質瘤是最常見的神經系統腫瘤，根據WHO分級可分為I-IV級，其中惡性程度最高的是膠質母細胞瘤(IV級)。化療、放療及手術治療對膠質瘤特別是膠質母細胞瘤的提高生存率及降低死亡率作用不明顯。膠質瘤中的線粒體功能失調包括：結構異常，線粒體膜電位改變，凋亡信號通路被擾亂，mtDNA突變，三羧酸循環相關酶突變等。線粒體融合增加，分裂減少，膠質瘤細胞絲狀偽足和樹突狀偽足中出現線粒體。膠質瘤細胞中線粒體脂肪代謝可促進活性氧異常增加，導致細胞凋亡。研究發現，膠質母細胞瘤患者中具有催化NADP+還原為NADPH功能的酶IDH1突變。研究證實，多種化療藥物(如紫杉醇)可通過靶向線粒體功能抑制膠質瘤。在多種腫瘤中，包括膠質瘤，細胞代謝從氧化磷酸化變成有氧糖酵解，這種代謝重構常伴有線粒體過度極化。膠質瘤細胞中的線粒體過度極化可被小分子口服藥二氯乙酸逆轉，繼而導致腫瘤細胞生長受限。三環類抗抑郁藥可促進膠質瘤細胞耗氧量降低、細胞色素C釋放，誘導細胞凋亡，但由于其副作用而應用受限。因此，靶向線粒體的藥物開發將成為治療膠質瘤潛在的有效的方法。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性大小在18nt～24nt的一類非編碼RNAs，目前已發現的miRNA有上千種。已證實，miRNA在細胞分化、增殖、凋亡等過程中發揮重要作用，通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(3’untranslated region，3’UTR)結合調控mRNA的翻譯和降解。miRNA因表達失調，在腫瘤的發生發展中的多個階段發揮重要作用。通過miRNA模擬體或者抑制劑調控miRNA的表達和活性可為抗腫瘤治療提供新的方法。線粒體中存在多種非編碼RNA，包括miRNAs、snoRNA、srpRNA、piRNA及重復序列相關的小RNA，在人類腫瘤中通常發揮類似癌基因或抑癌基因的作用，并且參與線粒體功能調控。

為進一步研究線粒體中miRNA在膠質母細胞瘤中的功能，需要在膠質母細胞瘤線粒體中過表達miRNA，但是現有的商業化載體和文獻報道的載體均不能有效實現。

發明內容

基于此，有必要提供一種可在線粒體中高效表達miRNA的miRNA表達載體。

一種miRNA表達載體，所述miRNA表達載體從5’端到3’端依次具有以下元件：第一啟動子、目標序列、第二啟動子和線粒體定位序列，所述目標序列由待表達miRNA的DNA序列重復多次得到。

在其中一個實施例中，所述目標序列由待表達miRNA的DNA序列重復三次以上得到。

在其中一個實施例中，所述待表達miRNA為miR-92b-5p、miR-25-5p或miR-34a-5p，其DNA序列分別如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示。

在其中一個實施例中，所述第一啟動子為U6啟動子，所述第二啟動子為CMV啟動子。

在其中一個實施例中，所述線粒體定位序列為COX8序列，序列如SEQ ID NO：4所示。

在其中一個實施例中，所述線粒體定位序列的3’端還具有標簽蛋白序列。