[發明專利]豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系及其應用

有效

• 申請號: 202010375566.8
• 申請日: 2020-05-07
• 公開（公告）號: CN111485004B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 肖一紅;丁國飛;蔡鑫娜
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10;C12N7/00;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93;C12R1/91
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發明公開了一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系及其在PRRSV疫苗生產中的應用。本發明所構建的細胞系生長特性與正常細胞無差異，該細胞系對不同類型的PRRSV均超易感，能使病毒感染滴度增高，感染時間縮短；可以用于PRRSV的快速高滴度制備，同時為PRRSV疫苗的生產提供高效細胞系。

技術領域

本發明涉及生物學技術領域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系及其在PRRSV疫苗生產中的應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)是一種只感染豬的高度接觸性傳染病病原，是目前危害養豬業的首要傳染病之一。僅美國每年由于PRRSV感染引起的經濟損失高達60億美元。PRRSV分為歐洲型和北美型，在我國主要流行北美型。目前臨床上常見的毒株有經典低致病性PRRSV(LP-PRRSV)、高致病性PRRSV(HP-PRRSV)和2013年暴發的NADC30-like三種類型的毒株。疫苗免疫是目前該病的預防的主要手段。目前商品化的PRRSV疫苗有減毒活疫苗和滅活疫苗，由于滅活疫苗免疫效果較差，所以臨床上主要以減毒活疫苗為主。減毒活疫苗需要將疫苗生產用的標準毒種接種到動物細胞上，適當培養若干時間后，收獲細胞培養物，分離純化后的病毒便是病毒疫苗生產使用的直接或間接原料。因此構建傳代細胞，獲得高滴度和免疫原性好的傳代細胞適應株是疫苗生產過程中重要的關鍵技術之一。

但由于PRRSV具有高度的變異性，變異株不僅在基因組上發生變化，而且在毒力和誘導的機體的免疫反應等方面都發生了變化，因此，不同類型的PRRSV在同一動物細胞上的感染適應能力可能存在較大差異，在制備不同類型PRRSV的減毒活疫苗時，病毒的感染能力及高滴度病毒的生產嚴重制約了PRRSV減毒活疫苗的生產與應用。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系，本發明所構建的細胞系可支持不同類型的PRRSV快速繁殖，能使病毒感染滴度增高，感染時間縮短；可以用于PRRSV的快速高滴度制備，同時為PRRSV疫苗的生產提供高效細胞系。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系的構建方法，包括以下步驟：

以靶標1和靶標2作為CLDN4基因的雙敲除靶序列，利用CRISPR-Case9技術對動物細胞中CLDN4基因進行完全敲除，即構建得到豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系；

所述靶標1的正義鏈序列如SEQ ID NO.1所示，反義鏈序列如SEQ ID NO.2所示；所述靶標2的正義鏈序列如SEQ ID NO.3所示，反義鏈序列如SEQ ID NO.4所示。具體如下：

靶標1正義鏈：CACCGTGCCTCGCTCTACGTCGGCTGGG(SEQ ID NO.1)；

靶標1反義鏈：AAACCCCAGCCGACGTAGAGCGAGGCAC(SEQ ID NO.2)。

靶標2正義鏈：CACCGCCCGCCCCGTACAGACAAGCCTT(SEQ ID NO.3)；

靶標2反義鏈：AAACCAAGGCTTGTCTGTACGGGGCGGG(SEQ ID NO.4)。

優選的，所述動物細胞為Marc-145細胞。

采用本發明的構建方法，可以將動物細胞中的CLDN4基因完全敲除，無脫靶效應；而且敲除CLDN4基因后不改變細胞生長特性。

本發明的第二方面，提供上述方法構建的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒超易感細胞系。