[發明專利]一種豬圓環病毒3型實時熒光定量PCR檢測引物探針組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010374676.2
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111621596A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 楊斌;黃紅亮;陳瑞愛
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 龔元元

1.一種豬圓環病毒3型TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測引物和探針組，其特征在于，所述檢測引物和探針組的核苷酸序列如下所示：

上游引物PCV3-F1：5’TAAACGAATGGGAAACTGCC 3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物PCV3-R1：5’TTCCGCATAAGGGTCGTCT 3’(SEQ ID NO：2)；

熒光探針PCV3-Pn：5’CACTCAGCCCTGTAAT 3’(SEQ ID NO：3)。

2.一種豬圓環病毒3型TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1所述的檢測引物和探針組。

3.根據權利要求2所述的一種豬圓環病毒3型TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含反應混合液和ddH2O。

4.一種利用權利要求1所述的引物和探針組檢測豬圓環病毒3型的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取豬圓環病毒3型病料組織中的病毒DNA；

(2)將步驟(1)中的病毒DNA使用引物PCV3-F1和PCV3-R1進行PCR擴增，膠回收并純化PCR擴增產物，將回收純化后的PCR產物與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌JM109，得到重組標準質粒pMD18-T-JM109；

(3)將步驟(2)制得的重組標準質粒pMD18-T-JM109作為標準品，測定其濃度并計算起始質粒拷貝數，然后進行10倍梯度稀釋；

(4)將步驟(3)中各稀釋梯度的標準品及待測樣品分別作為反應模板進行TaqMan實時熒光定量PCR反應，建立豬圓環病毒3型TaqMan實時熒光定量PCR檢測的標準曲線，根據標準曲線計算待測樣品中豬圓環病毒3型核酸拷貝數，即為豬圓環病毒3型的含量。

5.根據權利要求4所述的一種豬圓環病毒3型的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述TaqMan實時熒光定量PCR反應體系為：濃度為2x的反應混合液10μL，濃度均為10μM的引物PCV3-F1、PCV3-R1、探針PCV3-Pn各0.4μL，ddH2O7.8μL，DNA模板1μL。

6.根據權利要求4所述的一種豬圓環病毒3型的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述TaqMan實時熒光定量PCR反應條件為：95℃預變性3min，95℃變性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，45個循環。