[發明專利]灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010370240.6
• 申請日: 2020-05-06
• 公開（公告）號: CN111471792A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 石勇;孫宗科;朱建寧;張鐳;沈頌東;車團結;高愷;李瀟玲;鄭曉玲
• 申請（專利權）人: 蘭州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉小彬

本發明公開了灰葡萄孢的RT?QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法，屬于生物技術領域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；試劑盒包括上述引物及探針。熒光定量PCR檢測方法包括：提取待測樣品總DNA；制備反應體系；將模板梯度稀釋制成標準曲線樣品及陽性對照樣品；將待測樣品、標準曲線樣品、陽性對照樣品、陰性對照樣品使用引物和探針進行熒光定量PCR擴增；繪制標準曲線，計算結果。本發明的引物、探針及試劑盒，具有高度特異性和良好的靈敏度，能快速、準確度地灰葡萄孢進行檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術

灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是葡萄等多種植物灰霉病的病原菌，例如它容易感染天竺葵、西紅柿和草莓。灰霉病由灰葡萄孢菌侵染所致，屬真菌病害，花、果、葉、莖均可發病。灰霉病病苗色淺，葉片、葉柄發病呈灰白色，水漬狀，組織軟化至腐爛，高濕時表面生有灰霉。幼莖多在葉柄基部出現不規則水浸斑，很快變軟腐爛，縊縮或折倒，最后病苗腐爛枯萎病死。灰葡萄孢菌是葡萄孢屬中的一類絲狀子囊真菌，根據其培養性狀、分生孢子梗和分生孢子的形態特征進行鑒定，然而形態學鑒定不能區分不同的生物物種和具有共同形態特征而基因多樣的有絲分裂菌株，如若采用傳統的鑒定方法，容易出現偏差，且耗時較長。

現有技術中，采用多重PCR檢測灰葡萄孢雖然特異性好、準確性高，然而其PCR結果需要通過瓊脂糖電泳進行分析，影響因素較多。隨著分子生物學技術的不斷發展，RT-QPCR(實時熒光定量PCR)目前已廣泛應用于菌種的檢測。其與常規的分離培養方法相比，具有耗時短、操作簡便、特異性好的特點，且結果可直接觀察，能有效避免操作過程中引起的污染。但灰葡萄孢與其它鐮刀屬菌種有著較高的同源性，如腐皮鐮刀菌、三線鐮刀菌、尖孢鐮孢、禾谷鐮刀菌。因此提供一種用于灰葡萄孢的PCR檢測方法，具有高度特異性，準確度高，成為了本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的之一在于，提供一種灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的引物，特異性好，準確度高。

本發明的目的之二在于，提供一種灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的探針。

本發明的目的之三在于，提供一種灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的試劑盒。

本發明的目的之四在于，提供一種灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明通過對NCBI數據庫中灰葡萄孢18SrRNA基因全序列進行生物信息學比對分析，選取適合設計引物和探針的保守片段序列為靶目標，并進一步應用Primer express 3軟件、 Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設計了多組實時熒光定量PCR引物與探針，經過試驗初步篩選，最終確定了一組用于檢測灰葡萄孢的熒光定量PCR引物和探針。

本發明所述的灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

上游引物：5'-ATTTACAGAGTTCATGCCCGAAA-3'；

下游引物：5'-TGCCAGAACCAAGAGATCCG-3'。

本發明所述的灰葡萄孢的RT-QPCR檢測的探針，該探針的核苷酸序列如SEQ IDNO:3 所示：5'-TCTCTGGCGAGCATACAAGG-3'；優選地，所述探針5’端標記的熒光報告基團為VIC，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。

18SrRNA基因廣泛存在于灰葡萄孢中，具有很高的保守性。本發明采用灰葡萄孢18SrRNA基因作為靶序列，合成了引物及探針。