[發明專利]一種高產法尼烯的重組菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010366859.X
• 申請日: 2020-04-30
• 公開（公告）號: CN111607545B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 張海波;門瀟;咸漠;劉晉鋒
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種高產法尼烯的重組菌及其構建方法與應用，屬于微生物技術領域。為了進一步提高大腸桿菌合成法尼烯的產量、提升合成途徑上酶的催化效率和穩定性，本發明提供了一種合成法尼烯的基因工程菌，所述基因工程菌過表達mvaE、mvaS、ERG12、ERG8、ERG19、AaIDI、ispA以及帶有D18定位肽的β?法尼烯合成酶D18?AaFS基因。所述基因工程菌發酵96h法尼烯產量達到35.93g/L，有利于推動生物法合成法尼烯的工業化進程。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種高產法尼烯的重組菌及其構建方法與應用。

背景技術

法尼烯(farnesene)，分子式C₁₅H₂₄，又稱金合歡烯，是一種鏈狀倍半萜烯。法尼烯因具有芳香氣味和抗氧化等活性，可作為添加劑應用于日化、醫藥、食品等工業；還可作為信息素，應用于農業害蟲的生物防治；此外，法尼烯還是合成維生素E側鏈的重要中間體。近年來，萜烯類生物燃料越來越受到關注。法尼烯的加氫產物法尼烷(farnesane)因具有高十六烷值和較低的碳排放，被認為是極具潛力的航空航天領域新型生物燃料，并已通過ASTMD7566航空燃料標準的測試。

天然法尼烯存在于多種植物精油中。但是植物中法尼烯含量低，提取成本高，易受原料限制；而化學法合成法尼烯需要專門儀器設備，步驟復雜，能耗高，易產生污染。隨著基因工程和合成生物學的發展，利用工程微生物來生產法尼烯已經實現。通過引入外源途徑，利用大腸桿菌(Escherichia coli)合成法尼烯的產量在搖瓶水平達到5.40g/L(發酵96h)，在發酵罐水平達到8.74g/L(發酵120h)。通過改造內源途徑和引入合成酶，利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)合成法尼烯的產量在20萬升工業級發酵罐水平達到130g/L以上(發酵兩周)。魚腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)僅利用二氧化碳、光照和微量元素合成法尼烯的產量達到69.1±1.8μg·L^-1·O.D.^-1·d^-1。由于法尼烯本身對常見宿主沒有毒性，有望通過基因工程改造或發酵技術改進來進一步提高其產量。

細菌微區室(bacterial microcompartments,BMCs)是20世紀50年代在藍細菌中發現的一類以蛋白質為基礎的多面體亞細胞結構，它能提高底物、酶、輔助因子的濃度，產生底物通道效應，提高原核生物的代謝效率；能隔離有毒代謝產物對細胞的傷害以及外界條件變化對被包裹酶活性的影響；還能減少分支或競爭代謝途徑對目的產物產量的影響。BMCs體系具有應用于合成生物學的巨大潛力。將BMCs的定位肽添加到合成途徑酶的N端，能夠使酶聚集或者固定化，從而提高外源途徑的代謝效率。

發酵罐發酵技術也是影響目的產物產量的重要因素。例如，培養基成分(碳氮比)、攪拌轉速、溶氧、溫度、pH、補料成分與方式等都會影響菌體的生長、質粒的穩定性、酶的表達和活性、副產物的生成等，從而影響產物的產量。不斷優化和尋找最適發酵條件，對于法尼烯產量的提高具有重要意義。

發明內容

為了進一步提高大腸桿菌合成法尼烯的產量，我們將BMCs的定位肽D18添加到法尼烯合成酶AaFS的N端，構建了合成法尼烯的重組菌；并通過發酵罐發酵技術的優化，使法尼烯產量有了顯著提升。本發明采用技術方案如下：

本發明通過Gibson Assembly方法構建了pTrc-ERG12-ERG8-ERG19和pET28a-(D18-AsFS)-ispA-AaIDI兩個質粒。將以上兩個質粒和pACYC-mvaE-mvaS共轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得產法尼烯的重組菌。挑取單菌落進行發酵，通過IPTG誘導表達和TRPO原位萃取獲得含有法尼烯的樣品，通過氣相色譜和法尼烯標準品曲線對樣品進行定量分析。