[發明專利]用于早期胰腺腫瘤檢測分子標志物、其檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010356498.0
• 申請日: 2020-04-29
• 公開（公告）號: CN111575374B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 肖桂山;肖曉鶯
• 申請（專利權）人: 大連凱倫生物科技咨詢有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/113
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 祝詩洋

本發明公開了用于早期胰腺腫瘤檢測分子標志物、其檢測方法及應用，屬于生物技術及臨床分子診斷藥物開發領域。該胰腺癌標志物miRNAs：miR?30c、miR?24、miR?23a和miR?132。本發明所提供的組合、方法和試劑盒能夠用于早期胰腺癌的篩查與鑒別診斷、疾病并發癥發生和復發的監測、療效、藥效及指導精準用藥等方面評價，具有檢出譜系廣、靈敏度高、特異性好、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優點，該方法可廣泛用于胰腺癌早期普查和預后等相關工作，改進單一的標記物或目前臨床廣泛應用的生物標志物本身的不穩定性所難以克服的個體差異、所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高早期胰腺癌的臨床檢出率、降低對胰腺癌誤診率和漏診率，成為早期胰腺癌篩查和診斷的有效手段。

技術領域

本發明屬于生物技術及臨床分子診斷藥物開發領域，特別涉及能區分早期胰腺癌、胰腺炎及胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤病變以及正常人血液檢測標志物、PCR(多聚酶聯反應)或任何以這些標志物為檢測手段的方法和試劑盒。

背景技術

早期胰腺癌通常指腫塊直徑≤2.0cm，無淋巴結轉移，無胰腺被膜和胰周浸潤，無血管和鄰近臟器侵犯的胰腺癌，分期屬T1aN0M0。但是有學者認為，1.0cm～2.0cm的胰腺癌大多已發生了淋巴結轉移，主張腫瘤直徑≤1.0cm為早期胰腺癌的標準。除非病灶恰巧位于十二指腸乳頭處，可以早期出現膽胰管梗阻癥狀以外，極少有臨床癥狀。另有學者提出，早期胰腺癌和小胰腺癌的定義有所區別，后者主要是指腫瘤最大直徑≤2.0cm，而無論有無淋巴結轉移。因此，早期胰腺癌的診斷，應重點在于高危人群的篩查、分子生物學診斷和探索新的影像檢查手段。

目前臨床應用最為廣泛的胰腺癌診斷手段，即應用多種影像學方法來鑒別疑似胰腺癌患者的腫瘤，其中包括腹部B超、計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、內鏡超聲(EUS)和正電子發射斷層掃描(PET)。由于胰腺癌腫瘤所處于人體內臟的深處，在初期沒有明顯的臨床表現，并且在微小癌灶時期難以用放射成像進行診斷，導致大部分胰腺癌患者在確診時已進入晚期，病灶已經轉移，患者喪失用手術進行治療的機會。

考慮到影像檢測手段的局限性，研究者們開始思考是否可以利用人體體內的某些生物分子作為診斷靶標，從而提高診斷的特異性。因此在近些年，人們熱衷于開發新型生物標志物。關于胰腺癌的生物標志物的研究也有很多，但是很少能被證明是有效的檢測早期胰腺癌。目前，碳水化合物類抗原19-9(CA?19-9)是應用最廣泛的胰腺癌生物標志物。然而，由于CA19-9、CA125、CA50、TIMP-1、及CEA對胰腺癌的診斷敏感性和特異性都較低(都在30～40％和60％左右)，因此它們并不是篩查和早期檢測胰腺癌的最佳診斷標，其主要臨床應用是作為監測病情進展和治療反應的標志物。

現有技術中CN101942502A和發明人的在先申請CN109423519A雖然公開了采用微小核糖核酸作為檢測臨床早期胰腺癌診斷的用途，但現有技術中都是用單一檢測指標來判斷，并且所發明的單一miRNAs并不是最靈敏的，不是最能反映臨床病人體內實際情況的，缺乏綜合考慮每種miRNAs個體化臨床上表征，有可能導致其產品檢測結果不能真實反映病人實際狀況，造成漏診和誤診。

傳統的miRNA的檢測技術主要是Northern?Blotting印跡法、微陣列、原位雜交(ISH)和核酸擴增技術。如今，盡管在開發miRNA檢測技術的研究方面已經取得許多進展，但是仍然存在以下的問題亟待解決：

1)目前，雖然已經報道了許多種miRNA檢測方法，但可商業化且推廣至臨床的技術主要還是PCR。但是普通的RT-PCR并無法達到實際所要求的高靈敏度、準確性以及特異性，并且面對臨床大規模樣品，如何實現快速且大批量檢測是技術難點；

2)通常一個miRNA可以同時調控多種功能，與多種疾病息息相關。因此，開發可同時檢測多種目的miRNA的高通量檢測技術是非常重要的；