[發(fā)明專利]基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010350604.4
• 申請日: 2020-04-28
• 公開（公告）號: CN111500772B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 卞蓮蓮;高帆;孫世洋;梁爭論;毛群穎;吳星
• 申請（專利權(quán)）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

本發(fā)明公開了一種基于PMA?qRT?PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速檢測方法，將人二倍體細(xì)胞和甲型肝炎疫苗孵育后，加入終濃度為50μM的PMA，混勻，2?8℃避光孵育30min后置于光解儀上光解30min；然后抽提核酸，用qRT?PCR試劑盒進(jìn)行定量檢測，并以標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果繪制回歸曲線，以所得結(jié)果表示待測樣品的病毒滴度。本發(fā)明的檢測方法1天即可完成全部實驗，極大縮短了檢驗周期，且具備良好的線性、平行性、靈敏度、重復(fù)性、相關(guān)性、特異性和適用性，可檢測法定方法測定滴度為5.0～8.0lgCCID₅₀/ml的樣品，滿足國內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于甲型肝炎疫苗成品病毒滴度檢測范圍的要求。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及病毒滴度檢測方法，具體涉及一種基于PMA-qRT-PCR法的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速檢測方法。

【背景技術(shù)】

甲型肝炎病毒(HAV)為小RNA病毒科，肝炎病毒屬。基因組由單股正鏈RNA構(gòu)成，長度約為7.5kb，包含1個ORF及兩端非編碼區(qū)序列，在5′末端以共價形式連接一個由病毒基因編碼的細(xì)小蛋白質(zhì)，稱病毒基因組蛋白(VPg)，3’端有Poly(A)尾。HAV是引起甲型病毒性肝炎(甲肝)的主要病原體，主要以人類、獼猴和人猿等靈長類動物為宿主，以糞-口傳播為主。HAV在全球范圍內(nèi)均有流行，流行程度與衛(wèi)生、清潔狀況和國家發(fā)達(dá)程度密切相關(guān)。疫苗可有效控制甲肝的爆發(fā)和流行，我國已于2008年將兒童接種甲型肝炎疫苗列入國家免疫規(guī)劃，推動我國甲肝的防控工作。

甲型肝炎疫苗包括凍干甲型肝炎減毒活疫苗和甲型肝炎滅活疫苗。其中凍干甲肝減毒活疫苗的主要活性成分為減毒后的HAV。我國選育了兩株符合減毒活疫苗生產(chǎn)要求的病毒株H2和L-A-1株，采用人胚肺二倍體細(xì)胞(KMB17和2BS細(xì)胞株)作為細(xì)胞基質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)、收獲、提取病毒，加入穩(wěn)定劑凍干制成減毒活疫苗。目前，我國有3家企業(yè)生產(chǎn)凍干甲型肝炎減毒活疫苗，分別為浙江普康生物技術(shù)股份有限公司(浙江普康)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所(昆明所)和長春生物制品研究所有限責(zé)任公司(長春所)。甲肝滅活疫苗是采用甲醛滅活的全病毒滅活、純化疫苗，細(xì)胞基質(zhì)為人胚肺二倍體細(xì)胞(KMB17和2BS細(xì)胞株)，主要活性成分為HAV抗原，加入氫氧化鋁、磷酸鋁或者流感血凝素作為佐劑制成的液體疫苗。2002年我國北京科興生物制品有限公司(北京科興)采用TZ84株，經(jīng)病毒提取、純化、滅活成功研發(fā)的甲肝滅活疫苗上市應(yīng)用。之后，昆明所采用呂8株也成功研發(fā)甲型肝炎滅活疫苗。

病毒滴度是評價凍干甲型肝炎減毒活疫苗有效性的重要指標(biāo)，同時也是甲型肝炎滅活疫苗生產(chǎn)工藝中(如收獲液階段)質(zhì)量控制的關(guān)鍵項目。由于HAV一般不致細(xì)胞病變(CPE)，因此HAV病毒滴度不能以CPE的出現(xiàn)和程度為判斷依據(jù)。《中國藥典》2015年版的法定檢測方法為細(xì)胞培養(yǎng)-ELISA法，可反映疫苗HAV感染性病毒滴度水平。但該方法存在檢定周期長(約1個月)、細(xì)胞培養(yǎng)量大、操作繁瑣和定量準(zhǔn)確性較低等問題，成為甲肝疫苗質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，急需建立快速檢驗甲肝疫苗病毒滴度的方法。

有學(xué)者采用RT-PCR法檢測HAV滴度，該方法具有靈敏度高、特異性好、操作時間短的優(yōu)點，但不能區(qū)分感染性病毒和失活病毒。1994年Ricardo L.Chaves建立了鏈特異性PCR法檢測HAV感染性滴度，可特異性檢測HAV在復(fù)制過程中產(chǎn)生的負(fù)鏈中間體，區(qū)分感染性與非感染性病毒。2008年我國學(xué)者周健運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)/鏈特異性PCR法進(jìn)行甲肝滅活疫苗的滅活驗證試驗，結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA法檢測結(jié)果相同。2015年夏青娟根據(jù)HAV基因組序列設(shè)計了5條特異性引物，將甲型肝炎減毒活疫苗感染2BS細(xì)胞，收獲增殖高峰期的HAV，提取RNA后進(jìn)行兩輪鏈特異性PCR擴(kuò)增，檢測HAV復(fù)制過程中的負(fù)鏈RNA，通過Reed-Muench公式計算HAV感染性滴度。但上述的研究沒有對引物進(jìn)行特異性的實驗驗證，即無法證明擴(kuò)增的是負(fù)鏈，而非正鏈。其研究成果也未有進(jìn)一步應(yīng)用進(jìn)展。