[發明專利]一種表達酪氨酸酚裂解酶活性包涵體的大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202010350471.0
• 申請日: 2020-04-28
• 公開（公告）號: CN111733152B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 周景文;陳堅;韓紅梅;曾偉主;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種表達酪氨酸酚裂解酶活性包涵體的大腸桿菌及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明以大腸桿菌BL21作為宿主，表達重組質粒pET?28(a)?TPL及9個分別與酪氨酸酚裂解酶羧基端融合的功能性短肽，得到了生產L?DOPA的重組大腸桿菌，利用獲得的重組菌全細胞轉化生產L?DOPA，其中菌株TPL?ELP10,TPL?EAK16,TPL?18A,TPL?GFIL16全細胞反應的L?DOPA產量分別為37.8±1.5g/L,53.8±2.1g/L,37.5±0.5g/L,29.1±1.9g/L,相比于對照菌株分別提高111％,201％,109％,62.6％。

技術領域

本發明涉及一種表達酪氨酸酚裂解酶活性包涵體的大腸桿菌及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

左旋多巴(L-DOPA)是氨基酸的一種衍生物，也是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產物，又稱3,4-二羥基苯基丙氨酸，是一種重要的活性物質。L-DOPA是新型的生化藥品，在食品、醫藥和保健品等領域都具有廣泛應用。L-DOPA的衍生物——多巴胺是一種重要的神經遞質，由于多巴胺不能透過血腦屏障進入腦組織，所以不能通過補充多巴胺來治療帕金森氏病，而L-DOPA可以通過血腦屏障，并在腦組織中脫羧形成多巴胺，從而使腦組織中多巴胺含量增加而達到治療的目的。

Birkmayser于1961年用L-DOPA治療帕金森氏病獲得明顯療效。L-DOPA及復方L-DOPA(如美多芭)已成為治療常見老年病——帕金森氏病的主要藥物。L-DOPA還可用來治療弱視；利用酪氨酸酶將L-酪氨酸轉化，經L-DOPA形成黑色素，可用于毛發染色；此外，人們還發現L-DOPA有抗衰老的功效。基于L-DOPA在醫藥衛生、保健美容等諸多領域的顯著功效，L-DOPA的生產很早就被人們所關注。

L-DOPA在自然界中主要存在于蠶豆、毛豆等植物中，提取法中免去了與手性異構體D-DOPA的拆分工藝，并且L-DOPA的提取得率也相應得到了一些提高，但由于受到原料來源少、產量低的限制，因而生產成本高，從植物中提取L-DOPA難以大規模生產，遠不能滿足市場需求。化學合成法雖然被廣泛應用于L-DOPA的商業化生產，但化學合成過程中需要大量的鉛等金屬作為催化劑，并且過程繁雜，產物的轉化效率和對映選擇性均較低，同時具有成本高、環境污染嚴重等問題。以酪氨酸酶、對羥基苯乙酸酯3-羥化酶和酪氨酸酚裂解酶為主要生物催化劑的酶轉化法能夠有效克服化學法帶來的環境問題，上述酶法轉化合成L-DOPA的路線中以酪氨酸酚裂解酶活性最高，最接近工業化應用，但當反應底物之一鄰苯二酚濃度高于0.1M時，其對酪氨酸酚裂解酶活性具有抑制作用，對細胞也具有一定的毒性，目前主要采用底物流加補料策略，因此，解除鄰苯二酚的抑制作用和毒性是實現酪氨酸酚裂解酶酶法制備L-DOPA產業化的關鍵。

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，它作為一種模式微生物已經應用于諸多氨基酸的工業化發酵生產中，如谷氨酸、纈氨酸等。近年來學者們開始研究利用大腸桿菌全細胞轉化法生產非氨基酸物質。大腸桿菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌體污染的概率較低等優點，因此它在生物技術領域發揮著重要作用。在大腸狀桿菌中因為不存在酪氨酸酚裂解酶，不存在通過丙酮酸鈉、鄰苯二酚和銨鹽為底物合成L-DOPA的途徑。因此，提供一種能夠高效表達外源酪氨酸酚裂解酶基因的大腸桿菌，對于左旋多巴的生產應用具有重要的意義。

發明內容

本發明通過同源臂重組方法將合成的短肽基因無縫克隆至酪氨酸酚裂解酶的羧基端，再在大腸桿菌中表達融合功能性短肽的酪氨酸酚裂解酶，在不影響大腸桿菌生長情況的同時提高了其全細胞反應L-DOPA的合成量。

本發明的第一個目的是提供融合功能短肽的酪氨酸酚裂解酶；所述酪氨酸酚裂解酶的C端融合SEQ ID NO.1～9任一所示的短肽。

在一種實施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶為如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.10所示的氨基酸組成的蛋白質，