[發明專利]從污染霉菌的海帶配子體克隆中獲取無菌配子體的方法

在審

• 申請號: 202010349200.3
• 申請日: 2020-04-28
• 公開（公告）號: CN111548982A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 羅世菊;武瑞娜;趙聚萍;賽珊;錢瑞;王利芹;李霞;陳書秀;李曉捷
• 申請（專利權）人: 山東東方海洋科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 煙臺雙聯專利事務所(普通合伙) 37225
• 代理人: 姜宏藝

本發明是一種從污染霉菌的海帶配子體克隆中獲取無菌配子體的方法，霉菌污染的海帶配子體克隆粉碎、過濾后置于培養皿中，弱光環境下培養，使配子體絲狀體附著于培養皿底部；采用微吸管分離法，在顯微鏡下將細胞狀態好且無菌絲附著的單個細胞段，用微吸管吸取分離至滅菌的蓋玻片上，然后進行一次鏡檢以確保蓋玻片上所分離的細胞段無菌絲污染；經過二次培養后將克隆粒轉移到滅菌培養皿中，進行二次鏡檢得到無菌配子體。采用本發明的方法，只要得到一個無污染的細胞段，分離即成功，就是一個配子體克隆系的保存成功。

技術領域

本發明涉及從污染霉菌的海帶配子體克隆中獲取無菌配子體的方法。

背景技術

海帶是我國養殖的重要經濟海藻之一，養殖產量連續多年位居世界首位。保護好海帶種質資源是海帶養殖業健康持續發展的基礎。海帶具有明顯的世代交替生活史，一生包括孢子體世代和配子體世代。20世紀70年代海帶配子體無性繁殖系（克?。┡嘤晒ΑＥ渥芋w在一定條件下可進行無性繁殖形成克隆，由于海帶配子體克隆具有遺傳基礎純一、可長期保存、發育全能性特點，便于雜交，所以配子體克隆不單成為海帶種質保存對象，并且在海帶育種、育苗、生理及遺傳學研究中均發揮重大作用。保存無污染的海帶配子體克隆意義重大。

在海帶配子體克隆保存過程中，難免有空氣中霉菌孢子的污染，霉菌孢子落在液體培養基或克隆體上后，發芽生長并產生菌絲，菌絲互相交織而成菌絲體，纏繞海帶配子體克隆或深入克隆團內，影響種質的保存及配子體的生長，并且由于霉菌孢子極易散播，在更換培養液過程中，容易造成其他克隆系的污染，給種質庫種質的保存留下極大隱患，如果為了避免污染其他克隆系而丟掉污染的克隆系，會導致海帶優良種質的流失，給海帶種業帶來不可挽回的損失，影響海帶良種生產。

保存的克隆系一旦出現霉菌污染，可通過添加有效抗生素抑制霉菌菌絲生長，但無法達到完全去除的效果，并且抗生素使用濃度過大或者長期使用，對配子體細胞有直接影響，嚴重導致配子體死亡，濃度太低，藥物發揮不了作用，因此，對海帶種質保存而言，霉菌的存在永遠是個潛在的威脅。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種從污染霉菌的海帶配子體克隆中獲取無菌配子體的方法，分離并獲取無污染配子體作為長期保存對象。

本發明的技術方案如下：

從污染霉菌的海帶配子體克隆中獲取無菌配子體的方法，其特征在于按照以下步驟獲取無菌配子體：

（1）、配子體克隆材料的選取：海帶種質庫選取霉菌污染的配子體克?。?/p>

（2）、配子體克隆材料的粉碎：將選用的配子體克隆材料，采用超聲波細胞粉碎機進行粉碎得到配子體藻液；

（3）、配子體細胞段附著與培養：配子體藻液經過濾后置于培養皿中，在160倍鏡下每個視野含有3-5個細胞段，培養皿放置在溫度8-10℃，光強100-200Lux條件下，靜置培養3-5天，使配子體絲狀體附著于培養皿底部；

（4）、配子體絲狀體鏡下分離：采用微吸管分離法，在顯微鏡下，將細胞狀態好且無菌絲附著的單個細胞段，用微吸管吸取分離至滅菌的蓋玻片上，然后進行一次鏡檢以確保蓋玻片上所分離的細胞段無菌絲污染；

（5）、二次培養：將蓋玻片移至滅菌的盛有培養液的試管里并封口后放置在溫度10-12℃、光強1000-1500Lux、光時24h條件下進行培養，直至試管里分離的配子體細胞段長至1-1.5mm大小克隆粒；

（6）、二次鏡檢：將克隆粒剝離試管內壁，將克隆粒連同培養液一起倒入培養皿中，用移液器將克隆粒吸出并移入另一個滅菌培養皿中，在顯微鏡下全面觀察，無菌絲即得到無菌配子體，將無菌克隆粒用移液器移入試管，加培養液作為保存種質進行長久保存。

步驟（2）所述配子體克隆材料的粉碎：粉碎程度：粉碎成含有2-5個細胞的細胞段。