[發明專利]一種花藥培養與離體染色體加倍結合快速選育水稻新品系的方法

在審

• 申請號: 202010341778.4
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111528089A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 宋兆建;賀文婷;王杰;屈天歌;蔡得田;劉俊朋;王維;張獻華;何玉池;劉育華
• 申請（專利權）人: 湖北大學;武漢多倍體生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 丁齊旭

1.一種花藥培養與離體染色體加倍結合快速選育水稻新品系的方法，其特征在于過程為：a.不同水稻品種間雜交獲得雜種；b.雜種種植及花藥培養取材；c.材料低溫預處理；d.花藥培養獲得愈傷組織；e.愈傷組織離體染色體加倍；f.加倍后愈傷組織恢復培養；g.愈傷組織分化出苗；h.芽苗生根培養；i.試管苗移栽；j.倍性鑒定；k.綜合性狀鑒定。

2.根據權利要求1所述的一種花藥培養與離體染色體加倍結合快速選育水稻新品系的方法，其特征在于具體過程為：

a.不同水稻品種間雜交獲得雜種

選擇兩個具有不同優勢性狀的水稻品種或一個綜合性狀好但目標性狀需要改造的水稻品種、另一個具有目標性狀的水稻品種，將兩個水稻品種進行有性雜交獲得雜種F₁。

b.雜種種植及花藥培養取材

種植雜種F₁，植株孕穗期，選取葉枕距5～15cm、穎殼上部淺綠色下部淡黃色、雄蕊長度接近穎殼長度1/2的稻穗，將稻穗連同外部葉鞘、葉片一起取材。可取稻穗不同部位的穎花，挑出花藥，用1％I₂-KI溶液染色制片觀察，確保按上述外部形態標準所取稻穗的花粉大部分處于單核靠邊期。

c.材料低溫預處理

剪除稻穗上的葉片，保留最后三片葉的葉鞘，用經蒸餾水浸濕的紗布包裹后裝入自封袋，封口置于冰箱4℃條件下預處理7～10d。

d.花藥培養獲得愈傷組織

在超凈工作臺上剝出低溫預處理后的稻穗，經消毒處理后，挑取穎花中的花藥接種至花藥愈傷組織誘導培養基中，置于26～28℃、黑暗條件下培養，至愈傷組織形成。花藥愈傷組織誘導培養基配方：SK3+2,4-D 1.0mg/L～2.0mg/L+NAA 0.5mg/L～1.0mg/L+KT 0.5mg/L～1.0mg/L+CH 200mg/L+Sucrose 2.5％+Maltose 2.5％+Agar 0.75％，pH6.0。

e.愈傷組織離體染色體加倍

將生長旺盛的愈傷組織轉移至加倍培養基中，置于26～28℃恒溫搖床中，100～110rpm振蕩培養48～60h。加倍培養基配方：SK3+2,4-D 1.0mg/L～2.0mg/L+NAA 0.5mg/L～1.0mg/L+KT 0.5mg/L～1.0mg/L+Colchicine 300～500mg/L+CH 200mg/L+Sucrose 2.5％+Maltose 2.5％+Agar 0.75％，pH6.0。

f.加倍后愈傷組織恢復培養

將加倍處理后的愈傷組織用無菌水沖洗3～5次，接種至恢復培養基中，置于26～28℃、黑暗條件下恢復培養7～10d。恢復培養基配方：SK3+2,4-D 1.0mg/L～2.0mg/L+NAA 0.5mg/L～1.0mg/L+KT 0.5mg/L～1.0mg/L+CH 200mg/L+Sucrose 2.5％+Maltose 2.5％+Agar0.75％，pH6.0。

g.愈傷組織分化出苗

將恢復培養后的愈傷組織轉移至分化培養基中，置于25℃、黑暗條件下培養3～5d，再轉為光照12～14h/d條件下培養，至分化出苗。分化培養基配方：MS+6-BA 1.0mg/L～1.5mg/L+KT 1.0mg/L～2.0mg/L+NAA 0.2mg/L～0.3mg/L+Sucrose 3％+Agar 0.75％，pH6.0。

h.芽苗生根培養

待愈傷組織分化出的芽苗長至3～5cm時，將其轉入生根培養基中，25℃光照條件下培養，芽苗生根形成完整的小植株。生根培養基配方：1/2MS+6-BA 0.1mg/L～0.3mg/L+NAA0.3mg/L～0.5mg/L+Activated Carbon 0.02％+Sucrose 2％+Agar 0.75％，pH6.0。

i.試管苗移栽

待試管苗根數3～5條，根長2～3cm時，揭開培養瓶的封口膜，加入0.5～1cm深的無菌水，25℃煉苗2～3d；用清水洗凈試管苗根部的瓊脂后，移栽于水田或稻缽中，移栽后最初幾天注意遮陽及防淹水過深。

j.倍性鑒定

從形態學及結實性上基本可確定材料倍性，與單倍體植株相比，加倍單倍體為二倍體DH₁，植株較高、莖稈粗壯、可正常結實；相反，單倍體植株矮小、莖稈纖細、長勢弱、不結實。同時，可利用倍性檢測儀或流式細胞儀檢測細胞DNA含量、通過根尖染色體制片觀察染色體數目加以驗證。

k.綜合性狀鑒定

觀察鑒定通過上述倍性鑒定確認的二倍體植株DH₁，或DH₁單株收獲種子種植形成的株系DH₂的綜合性狀，篩選同時具有兩個親本優勢性狀的植株、或綜合性狀好且具有目標性狀的植株，從而獲得純合水稻新品系。