[發(fā)明專利]熱反應(yīng)蛋白單價(jià)及雙價(jià)納米抗體及其制備方法、應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010341773.1
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN111499745B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曲光剛;武曰星;沈志強(qiáng);單玉飛;王長江;趙中偉
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;G01N33/539
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

本發(fā)明提供了一種CRP單價(jià)及雙價(jià)納米抗體，所述納米抗體具有較高的ELISA效價(jià)，可以用于CPR的實(shí)驗(yàn)室和臨床檢測，且經(jīng)試驗(yàn)表明，CRP雙價(jià)納米抗體的親和活性比單價(jià)納米抗體增加了10倍，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。所述CRP單價(jià)及雙價(jià)納米抗體容易利用微生物進(jìn)行生產(chǎn)，并具有很高的產(chǎn)率，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及熱反應(yīng)蛋白CRP雙價(jià)納米抗體及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)

C反應(yīng)蛋白（C－Reactive，CRP）是由人體肝細(xì)胞合成，在正常狀態(tài)時濃度水平較低，而在出現(xiàn)感染、冠心病、心肌梗死等其他應(yīng)激反應(yīng)時，CRP濃度則可在4-6h 內(nèi)迅速提升，因此臨床上CRP 作為急性反應(yīng)蛋白，是診斷鑒別感染、監(jiān)測病情進(jìn)展、確定抗感染治療的重要指標(biāo)

單域抗體（variable domain of heavy chain of heavy －chainantibody，VHH），相對分子質(zhì)量約為15KD，僅為常規(guī)抗體的1/15，因此也被稱為納米抗體，它是目前天然來源的相對分子質(zhì)量最小的抗體。納米抗體由于其理化性質(zhì)穩(wěn)定、易于基因操作和克隆等優(yōu)勢，在疾病診斷、分子檢測和治療等方面受到廣泛關(guān)注。

自2014年首個雙特異性抗體藥物Blinatumomab進(jìn)入市場以來，人們對雙價(jià)和雙特異性抗體的研究興趣日益。與單價(jià)抗體相比，其對應(yīng)的雙價(jià)抗體具有更高的抗原結(jié)合活性，并且能夠顯著延長在體內(nèi)的半衰期；雙特異性抗體能夠識別相同抗原或不同抗原上的多個抗原表位，因此具有更廣泛的功能和用途。傳統(tǒng)抗體由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、二硫鍵多，在體內(nèi)精確組裝和體外純化等方面的困難限制了雙價(jià)傳統(tǒng)抗體的開發(fā)應(yīng)用。而納米抗體相對分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡單、易于進(jìn)行基因操作和可使用原核或真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的優(yōu)勢使其容易被開發(fā)成雙價(jià)或雙特異性納米抗體，以增加納米抗體在抗原檢測、疾病預(yù)防和治療等方面的應(yīng)用范圍。

本發(fā)明以CRP蛋白作為靶抗原，從CRP納米抗體文庫中篩選到CRP特異性的納米抗體序列，制備雙價(jià)納米抗體，提供了一種CRP納米抗體和CRP納米抗體雙價(jià)表達(dá)方法，在CRP檢測、診斷和治療領(lǐng)域有巨大前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，制備一種CRP雙價(jià)納米抗體，并探索其在乳膠增強(qiáng)透射免疫比濁法中的應(yīng)用。

一種CRP納米抗體，其特征在于，所述CRP納米抗體具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

編碼所述CRP納米抗體的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種CRP雙價(jià)納米抗體，其特征在于，所述CRP雙價(jià)納米抗體具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

編碼所述CRP雙價(jià)納米抗體的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明還提供了CRP納米抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟。

1）使用CRP抗原蛋白通過背部皮下多點(diǎn)注射方式對羊駝進(jìn)行免疫；

2）采集免疫后羊駝血液，分離得到淋巴細(xì)胞；

3）構(gòu)建抗體免疫庫，篩選納米抗體序列，得到CRP納米抗體序列；驗(yàn)證CRP納米抗體與CRP抗原蛋白結(jié)合。

特別指出，步驟3）中，篩選出的CRP納米抗體的核苷酸序列見SEQ ID No.2。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了CRP雙價(jià)納米抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟。

1）使用CRP抗原蛋白通過背部皮下多點(diǎn)注射方式對羊駝進(jìn)行免疫；

2）采集免疫后羊駝血液，分離得到淋巴細(xì)胞；

3）構(gòu)建抗體免疫庫，篩選納米抗體序列，得到CRP納米抗體序列；驗(yàn)證CRP納米抗體與CRP抗原蛋白結(jié)合；