[發(fā)明專利]一株賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010341570.2
• 申請(qǐng)日: 2020-04-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111454912B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胥傳來(lái);晁夢(mèng)佳;匡華;徐麗廣;孫茂忠;劉麗強(qiáng);吳曉玲;宋珊珊;胡擁明;郝昌龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/44;C07K14/765;C07D279/06;G01N33/577
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;張仕婷

一株賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株ABC09，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏日期2019年11月28日，保藏編號(hào)CGMCC No.19162。首先合成賽拉嗪半抗原，再制備賽拉嗪完全抗原，并將它免疫BALB/c小鼠，取高效價(jià)、低IC₅₀小鼠脾細(xì)胞，通過(guò)PEG方法與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法的篩選和三次亞克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株。此細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，對(duì)賽拉嗪具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度（IC₅₀為0.39ng/mL）。本發(fā)明成果可用于建立乳品和其他含有賽拉嗪的食品中賽拉嗪含量的免疫檢測(cè)方法，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

賽拉嗪（Xylazine，XYL）為鎮(zhèn)痛性化學(xué)保定藥，主要用于馬、牛、羊等動(dòng)物的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛。研究表明，賽拉嗪在食源性動(dòng)物組織中的殘留對(duì)消費(fèi)者造成的健康風(fēng)險(xiǎn)很大，長(zhǎng)期使用含有賽拉嗪殘留動(dòng)物源食品可能會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈，個(gè)別患者會(huì)出現(xiàn)精神失常。因此，建立有效的賽拉嗪殘留檢測(cè)方法，對(duì)有效控制牛奶產(chǎn)品中賽拉嗪的殘留，保障廣大人民群眾的身體健康，具有深遠(yuǎn)的意義。

賽拉嗪的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有高效液相色譜，液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜等，然而這些方法的前處理比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不適用于大量樣品的快速檢測(cè)，為了維護(hù)廣大消費(fèi)者的利益，有必要建立一種針對(duì)賽拉嗪的高效、快速的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，然而，使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)賽拉嗪的前提是得到對(duì)賽拉嗪具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體，因此，找到一種制備對(duì)賽拉嗪具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體的方法十分關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)賽拉嗪具有較高的檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立賽拉嗪的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一株賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株ABC09，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，分類命名為單克隆細(xì)胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏編號(hào)CGMCC No.19162。

賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w，它由所述保藏編號(hào)為CGMCC No.19162的賽拉嗪?jiǎn)慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株ABC09分泌產(chǎn)生。

免疫原賽拉嗪-BSA的合成，具體步驟如下：

（1）賽拉嗪半抗原的制備：將賽拉嗪（570 mg，2.59 mmol）和1,5-戊二酰氯（480.99mg，2.85 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL），并在冰浴中冷卻。然后將溶解在二氯甲烷（5mL）中的三乙胺（TEA）（314.18mg，3.10mmol）添加至所述溶有賽拉嗪的混合液中。添加30min后，溫度逐漸升至室溫。通過(guò)薄層色譜法（TLC）證明原料已被消耗。將反應(yīng)混合物在真空中濃縮，并通過(guò)快速柱色譜法純化（DCM：MeOH，1：0逐漸增加至40：1），得到化合物1（660 mg，1.70mmol，產(chǎn)率65.60％（w / w））。將化合物1（660 mg，1.70mmol）溶于N，N-二甲基甲酰（3mL）。然后將溶液加入水（3 mL）中，在其中白色固體會(huì)分離出來(lái)。過(guò)濾收集產(chǎn)物，隨后用DCM洗滌3次，并在真空下干燥。產(chǎn)生的白色固體即為賽拉嗪半抗原（412mg，1.23mmol，產(chǎn)率72.65％（w/ w））。半抗原合成路線詳見(jiàn)實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株ABC09的制備。